HPLC法同时测定加味穿心莲散中 6种成分

汪 芳, 林 吉*, 邓丽红, 朱 莉, 赖小平, 张 军

（1.广州中医药大学新药开发研究中心, 广东 广州 510006； 2.广东药学院, 广东 广州 510006）

[质 量]

HPLC法同时测定加味穿心莲散中 6种成分

汪 芳1, 林 吉1*, 邓丽红1, 朱 莉2, 赖小平1, 张 军1

（1.广州中医药大学新药开发研究中心, 广东 广州 510006； 2.广东药学院, 广东 广州 510006）

目的 建立同时测定加味穿心莲散 （穿心莲、木香、厚朴、苍术和干姜） 中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、 去氢木香内酯、 和厚朴酚及厚朴酚的高效液相色谱方法。 方法 加味穿心莲散甲醇提取液采用 Diamonsil C18（5 μm， 250mm ×4.6 mm） 色谱柱分离; 甲醇-水梯度洗脱， 体积流量为 1.0mL/min; 穿心莲内酯、 木香烃内酯、去氢木香内酯、 和厚朴酚及厚朴酚检测波长均为 225 nm， 脱水穿心莲内酯检测波长为 254 nm， 进样量为10 μL。 结果上述 6 种成分在 50min 内即达到基线分离， 且分别在 0.046 8 ～0.936 0 μg（r=0.999 99）、 0.051 0 ～1.020 μg（r= 0.999 99）、 0.101 3 ～2.026 μg（ r=0.999 95）、 0.154 1 ～3.081 μg（ r=0.999 96）、 0.050 9 ～1.018 μg（ r= 0.999 98）、 0.116 3 ～2.325 μg（r=0.999 61） 范围内呈良好线性关系， 各成分的平均加样回收率在99.3% ～104.0%之间， RSD小于 3%。 结论 本方法简单， 精确， 可重复， 并对加味穿心莲散改制成颗粒剂提供质量评价。

加味穿心莲散;穿心莲内酯;脱水穿心莲内酯;木香烃内酯;去氢木香内酯;和厚朴酚;厚朴酚

加味穿心莲散是由穿心莲、木香、厚朴、苍术和干姜等五味药材粉末制成的散剂，具有清热解毒、理气和中、除湿化滞的功效，主要用于治疗泻痢、积滞等肠道疾病。处方中穿心莲、木香和厚朴是起主要功效的药材，多含有热不稳定性成分和挥发油类成分，如:穿心莲中的穿心莲内酯在加热过程中容易脱水转化为脱水穿心莲内酯，并且加热也会导致内酯环的结构破坏， 使两者的总量下降［1］;木香烃内酯和去氢木香内酯为木香挥发油的主要成分， 也是木香的主要活性成分［2］， 在储藏过程中易损失，使药效降低;厚朴主要含有酚类和挥发油类，其中厚朴酚及和厚朴酚为厚朴的主要活性成分，但这2种成分在炮制过程中均易损失，造成市售商品质量参 差不齐［3-4］。 为了 有效地 控制产 品质量，本实验采用高效液相色谱法对处方中的穿心莲、木香和厚朴中的主要成分进行测定研究，为评价和控制该制剂的质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津 LC-20A高效液相色谱仪 （SPD-20A UV-VIS 检测器， LC-20AT泵， SIL-20A自动进样器， Labsolution 色谱工作站）; 十万分之一分析天平 （ 美 国 Mettler Toledo CP225D） ; 万分 之 一 分析 天 平 （ 美 国 Mettler Toledo AB204-N）;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器 （江苏昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药 穿心莲内酯对照品 （110797-201108），脱水穿心莲内酯对照品 （110854-201007）， 木香烃内酯对照品 （111524-201208）， 去氢木香内酯对照品 （ 111525-201008 ）， 厚 朴 酚 对 照 品 （ 110729-200412）， 和厚朴酚对照品 （110730-201112）， 均购于中国食品药品检定研究院; 苍术 （产地江苏，批号 110801）， 干姜 （产地江苏， 批号 111102），木香 （产地云南， 批号 130601）， 厚朴 （产地云南， 批号130501），均购于大翔制药有限公司; 穿心莲 （产地广西， 批号 11040250）， 购于华济中药饮片有限公司。水为超纯水;其余试剂为分析纯。加味穿心莲散由华南生物科技有限公司生产，批号分别为 20140105、 20140106、 20140107。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 经优选色谱条件， 确定固定相为Diamonsil C18色谱柱 （5 μm， 250 mm ×4.6 mm）;流动相为甲醇-水，按表 1 梯度洗脱; 穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚及厚朴酚检测波长均为 225 nm， 脱水穿心莲内酯检测波长为254 nm; 体积流量 1.0 m L/min; 进样量 10 μL。 在该色谱条件下，穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚及厚朴酚能达到基线分离， 其他成分对测定无干扰， 见图1。

表 1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2 混合对照品溶液的制备 取穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每 1 mL含穿心莲内酯 0.468 mg、 脱水穿心莲内酯 0.510 mg、 木香烃内酯 1.013 mg、 去氢木香内酯 1.541 mg、 和 厚 朴 酚 0.509 mg及 厚 朴 酚1.163 mg的对照品溶液。 再精密量取以上对照品溶液各 1 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含穿心莲内酯 0.046 8 mg、 脱水穿心莲内酯0.051 0 mg、 木香烃内酯 0.101 3 mg、 去氢木香内酯 0.154 1 mg、 和厚朴酚 0.050 9 mg及厚朴酚0.116 3 mg的混合对照品溶液， 摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约3 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇 50 m L， 称定质量， 超声处理 （功率 360 W， 频率 40 kHz）30 min， 放冷， 再称定质量， 用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方分别制备除去穿心莲药材、木香药材、厚朴药材的阴性样品，按照 “2.3” 项下的供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液 1、2、 6、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1” 项下的色谱条件进行测定。以对照品峰面积为纵坐标 （Y）， 对照品的进样量为横坐标 （X）， 分别进行线性回归， 得到的回归方程及相应的相关系数， 见表2。 结果表明，穿心莲内酯在 0.046 8 ～0.936 0 μg、 脱水穿心莲内酯在 0.051 0 ～1.020 μg， 木香烃内酯在 0.101 3 ～2.026 μg、 去氢木香内酯在 0.154 1 ～3.081 μg、 和厚朴酚在 0.050 9 ～1.018 μg、 厚朴酚在 0.116 3 ～2.325 μg范围内呈良好的线性关系。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chrom atogram s

表2 各对照品的回归方程和相关系数Tab.2 Regression equation and correlation coefficient of reference substances

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL， 按照 “2.1” 项下的色谱条件测定， 连续进样6次，测得各色谱峰的峰面积，穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的 RSD值分别为 0.5%、0.4%、 0.2%、 0.3%、 0.2%、 0.1%， 结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批样品粉末约3.0 g， 精密称定6 份，按照 “2.3” 项下的方法分别制备供试品溶液， 按照 “2.1” 项下的色谱条件分别进行测定，测得样品中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚的平均 含 有 量 的 RSD 值 分 别 为 1.0%、1.1%、0.6%、 1.0%、 0.8%、 0.4%， 结果表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液， 按照 “2.1” 项下的色谱条件分别在 0、 1、 2、 4、 8、24 h进样测定， 测得样品中穿心莲内酯、 脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴 酚 的 量 的 RSD 值 分 别 为 0.7%、0.5%、0.5%、0.2%、 0.6%、 0.4%， 结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 取同一批已知含有量的加味穿心莲散 6 份，每份约 1.5 g， 精密称定， 分别精密加入穿心莲内酯对照品溶液 1.20 m L、 脱水穿心莲内酯对照品溶液 1.50 mL、 木香烃内酯对照品溶液 2.00 mL、 去氢木香内酯对照品溶液 4.50mL、和厚朴酚对照品溶液3.20 m L及厚朴酚对照品溶液3.00 m L， 用甲醇补足至 50 m L， 再按照 “2.3” 项下的制备方法操作，进样测定，计算回收率，结果见表3～8。

表3 穿心莲内酯加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for andrographolide

表4 脱水穿心莲内酯加样回收率试验结果Tab.4 Results of recovery tests for didehydroand rographolide

表5 木香烃内酯加样回收率试验结果Tab.5 Results of recovery tests for costunolide

表6 去氢木香内酯加样回收率试验结果Tab.6 Results of recovery tests for dehydrocostuslactone

表7 和厚朴酚加样回收率试验结果Tab.7 Results of recovery tests for honokiol

表8 厚朴酚加样回收率试验结果Tab.8 Results of recovery tests for m agnolol

2.10 样品测定 取3 批加味穿心莲散样品，按照“2.3” 项下的方法制备供试品溶液， 各吸取 10 μL注入液相色谱仪中， 按照 “2.1” 项下色谱条件测定分别计算穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯、木香烃内酯和去氢木香内酯、和厚朴酚和厚朴酚的总量，结果见表9。

表 9 样品测定结果 （n=3）Tab.9 Determ ination resu lts of samples（ n=3）

3 讨论

本处方中的穿心莲、木香、厚朴分别为清热解毒药、行气药、芳香化湿药，三者均具有一定的抗炎、抗腹泻作用。如临床使用穿心莲注射液治疗仔猪白痢病和胃肠炎等症， 疗效显著［5］， 并且研究发现穿心莲内酯可有效缓解番泻叶和蓖麻油所致小鼠的腹泻［6］。 亦有文献报道， 木香可减少蓖麻油引起的小鼠小肠性腹泻和番泻叶引起的小鼠大肠性腹泻次数，对小鼠墨汁胃肠推进运动也有弱的抑制作用［7-8］。 而厚朴醇提物 只可对 抗番泻 叶性小 鼠腹泻， 对蓖麻油性腹泻无明显影响［9］。 此外，厚朴酚及和厚朴酚为厚朴的主要有效成分，其主要功效为抗腹泻作用，有文献表明厚朴酚及和厚朴酚可明显抑制番泻叶性小鼠腹泻［10-11］。

本实验建立了加味穿心莲散的穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、木香烃内酯、去氢木香内酯、和厚朴酚、厚朴酚的定量测定方法，对加味穿心莲散的6个指标成分进行了提取方式、溶媒种类、溶媒用量、提取时间的考察。在提取方式 （回流、超声）考察中，2种提取方式的结果相差不大，为了提取方便， 选择超 声 提 取; 溶 媒 种 类 （40% 甲醇、70%甲醇、 甲醇） 考察中， 结果显示直接用甲醇提取，各指标成分的提取率最大; 溶媒用量 （25、50、 75、 100 mL） 和提取时间 （20、 30、 40、 60 min） 考察中， 各指标成分的提取得率差异不大，考虑样品或饮片可能出现的波动及方法适用性，确定溶媒用量为 50 mL， 提取时间为 30 min。 本方法操作简单、省时、重复性好，同时测定加味穿心莲散中6种药效成分的量，具有实用价值。

本实验参考 《中国药典》 中穿心莲、木香、厚朴的成分定量测定［12］， 对色谱柱、 流动相、 体积流量及检测波长进行了筛选，并对梯度洗脱时间进行了优化。 此外， 《中国药典》 2010 年版中穿心莲、木香、厚朴这三味药材的成分定量测定分别是以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯、木香烃内酯和去氢木香内酯、厚朴酚与和厚朴酚的总量计的，所以本实验样品的测定结果也选择以三类成分的总量计。本实验所建立的加味穿心莲散的成分定量测定方法，为加味穿心莲散的质量标准控制提供了科学依据，并为后续颗粒剂的工艺研究奠定了基础。

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Sim ultaneous determ ination of six constituents in JiaweiChuanxinlian Pow der by HPLC

WANG Fang1， LIN Ji1*， DENG Li-hong1， ZHU Li2， LAIXiao-ping1， ZHANG Jun1

（1.Development&Research Center of New Chinese Drugs， Cuangzhou University of ChineseMedicine， Cuangzhou 510006， China;2.Cuangdong Medicine College， Cuangzhou 510006， China）

AIM To establish an HPLCmethod for simultaneously determining six constituents（ andrographolide， didehydroandrographolide， costunolide，dehydrocostuslactone，honokiol and magnolol） in Jiawei Chuanxinlian Powder（ Andrographitis Herba， Aucklandiae Radix， Magnoliae officinalis Cortex， Atractylodis Rhizoma， Zingiberis Rhizoma）.METHODS The separation was performed on Diamonsil C18（5 μm， 250 mm ×4.6 mm）column withmobile phase consisted ofmethanol-waterwith flow rate of1.0mL/min in gradientelutionmode.The detection wavelength was setat225 nm and 254 nm， respectively.RESULTS Six constituents could bewell separated at baseline in 50 min.The linearity ranges of six constituentswere 0.046 8 ～0.936 0 μg， 0.051 0 ～1.020 μg， 0.1013 ～2.026 μg， 0.154 1 ～3.081 μg， 0.050 9 ～1.018 μg， and 0.1163 ～2.325 μg， respectively.The correlation coefficients of them were0.999 99， 0.999 99， 0.999 95，0.999 96， 0.999 98 and 0.999 61，respectively.The average recovery ranged from 99.3%to 104.0%with RSD less than 3%.CONCLUSION The establishedmethod is simple， accurate， reproducible， and can be used for the quality assessment of Jiawei Chuanxinlian Powder prosessed into granules.

Jiawei Chuanxinlian Powder;andrographolide;didehydroandrographolide;costunolide;dehydrocostuslactone;honokiol;magnolol

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2521-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.017

2014-03-17

国家科技部 “十二五” 国家科技支撑计划课题 （2011BAI01B01）

汪 芳 （1988—）， 女， 硕士生， 主要从事复方中药新药研究与开发。 Tel: （020） 39358519， E-mail:wflzc101@163.com

*通信作者: 林 吉， 男， 研究员， 硕士生导师， 主要从事复方中药新药研究与开发。 E-mail:LinJi886@163.com