SPE-HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度

钱国华， 张梦玲， 徐玲玲， 敬应春*

（1.上海雷允上药业有限公司， 上海 201401； 2.上海中医药大学， 上海 201203）

SPE-HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度

钱国华1， 张梦玲1， 徐玲玲2， 敬应春1*

（1.上海雷允上药业有限公司， 上海 201401； 2.上海中医药大学， 上海 201203）

目的 采用固相萃取-高效液相色谱 (SPE-HPLC) 联用技术建立珍菊降压片 (野菊花膏粉、 珍珠层粉、 芦丁、氢氯噻嗪、 盐酸可乐定) 中盐酸可乐定的含量均匀度测定方法。 方法 以 Cleanert SCX-SPE阳离子固相萃取小柱对样品进行前处理， 色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm) ， 流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液 (10 ∶90)， 体积流量 1.0 mL/min， 柱温 30 ℃， 检测波长 220 nm。 结果 盐酸可乐定在 1.234 ～123.4 ng的测定范围内线性关系良好； 平均回收率为96.37%， RSD为 0.18%。 6 批珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度分别为12.32、 17.17、10.95、 9.36、 7.77、 11.35。 结论 该方法有效地消除了阴性干扰， 专属性、 灵敏度、 重复性和准确度良好， 为珍菊降压片中盐酸可乐定的含量均匀度评价提供了可靠的技术手段。

珍菊降压片；盐酸可乐定；固相萃取；高效液相色谱法；含量均匀度

珍菊降压片为临床常用降压药，其处方由野菊花膏粉、珍珠层粉、芦丁、氢氯噻嗪、盐酸可乐定构成，其中盐酸可乐定为α受体激动剂，具中枢降压作用，是主要有效成分。盐酸可乐定在珍菊降压片中理论含有量为 30 μg/片， 量少， 活性强，易出现含量均匀度方面的质量问题，造成用药安全隐患。由于盐酸可乐定只有紫外末端吸收，且量少， 阴性干扰严重， 使其 HPLC法定量检测异常困难，因此建立其专属、灵敏、准确的定量测定方法成为珍菊降压片质量控制和工艺评价需要首先解决的技术难题。珍菊降压片所执行的部颁标准中无盐酸可乐定定量测定项目。现有文献 ［1-8］中基本都采用溶剂萃取与pH调节相结合的方式进行样品前处理，此类方法操作繁琐，准确度和可操作性存在较大问 题， 不 适用 于 日 常检 测。 高 苏 亚 等［9］、SU Shengmin 等［10］、 丁飞等［11］采用毛细管电泳技术同时测定珍菊降压片中的盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁，取得较好的效果，但因仪器的普及问题， 难以在日常检验中推广。 许谙等［12］将 C18固相萃取小柱用于样品前处理，在测定珍菊降压片中的盐酸可乐定时取得了较好的效果，提供了新的思路。本实验根据目标组分与干扰组分间的电荷性质差异， 采用 SPE-HPLC联用技术，以阳离子固相萃取技术有效消除了盐酸可乐定测定时的阴性干扰，显著改善了方法的专属性、灵敏度、重复性和准确度，为珍菊降压片的质量控制提供了可靠的技术手段。

1 仪器与材料

Agilent1200 高 效 液 相 色 谱 仪 (VMD检 测 器，自动进样器)、Agilent1100 高效液相色谱仪 (DAD检测器， 自动进样器)， 美国安捷伦科技； LC-10AT高效液相色谱仪 (SPD检测器)， 日本岛津公司； BS224S 电子天平， Sartorius； SHZ-B水浴恒温震荡器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；CQ-250 型超声波清洗器［(33 ±3)kHz，250W)］，上海新超超声波仪器有限公司； SBEQ-CR1012 固相萃取 装置， 德 国 CNW 公 司； Cleanert SCX-SPE (200 mg/6 mL) ， Agela Technologies公 司； Milli-Q超纯水机，美国 Milli-Pore公司。

盐酸可乐定对照品 (批号 H11279)， 美国 USP公司； 珍菊降压片 (批号分别为 100717、 101031、101124、110406、 120309、 120310、120311，盐酸可乐定标示含有量为 30 μg/片)， 上海雷允上药业有限公司； 珍菊降压片阴性颗粒 (缺盐酸可乐定)， 实验室自制； 乙腈为色谱纯， Merck； 超纯水为实验室自制；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 取盐酸可乐定对照品适量，用 0.1 mol/L的盐酸溶液制成每 1 mL含盐酸可乐定 1.2 μg的溶液， 即得。

2.1.2 供试品溶液 取珍菊降压片 10 片， 置 10个磨口三角烧瓶中， 分别加入直径4～5 mm玻璃珠 15 g，精密加入 0.1 mol/L盐酸溶液 25 mL，密塞， 振摇至片芯完全破碎，超声提取 15 min， 摇匀， 滤过， 收集续滤液备用； 取 SCX固相萃取小柱 (200 mg/6 mL)， 依次用甲醇、 0.1 mol/L盐酸各5mL淋洗， 备用； 精密量取续滤液5.0mL上于SCX固相萃取小柱中， 待溶液流干后，依次用水、50%甲醇各 5 mL淋洗 (抽干)， 弃去淋洗液， 再用含2%氨水的 50%甲醇溶液 5 mL洗脱 (抽干)，收集洗脱液于10 mL量瓶中， 加入3 滴浓盐酸， 再用 0.1 mol/L盐酸溶液定容， 摇匀， 即得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液 取缺盐酸可乐定阴性颗粒适量， 研成细粉， 取细粉 0.25 g， 按 “2.1.2” 项方法操作，即得阴性对照溶液。

2.2 色 谱 条 件与 系 统 适 应 性 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液 (10 ∶90)； 体积流量 1.0 mL/min；柱温 30 ℃； 检测波长 220 nm；进样量20 μL。 以盐酸可乐定峰计算， 理论塔板数不低于8 000， 分离度不小于 2.0， 峰纯度不小于 998， 该方法专属性和系统适用性满足定量测定要求。对照品、 供试品、阴性对照图谱见图1。

图1 盐酸可乐定测定 HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram s of content determ ination of clonidine hydrochloride

2.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液 (质量浓 度 1.234 μg/m L)1、 5、 10、 20、 30、 60、100 μL， 注入液相色谱仪，依法测定。以对照品进样量(ng)为横坐标， 以盐酸可乐定峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线， 得回归方程 y=2.966 2x+ 0.048 5， r=0.999 99。 结 果 表 明 在 1.234 ～123.4 ng的进样范围内， 该方法线性关系良好。

2.4 稳定性考察 取同一份供试品溶液 (批号100717)， 分别在制备后 0、 4、 8、 12、 24 h 进样检测， 以测得的盐酸可乐定峰面积计， RSD为0.24%。 表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.5 仪器精密度考察 取对照品溶液 20 μL， 重复进样6 次， 以测得的盐酸可乐定峰面积计， RSD值为0.08%。 表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批珍菊降压片供试品(批号100717)，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试液，依法测定，以测得的供试品中盐酸可乐定计， RSD为0.44%。 表明该方法重复性良好。

2.7 中间精密度试验 取同一批珍菊降压片供试品，分别考察不同时间、不同人员、不同仪器三个变动因素下的中间精密度。以测得的供试品中盐酸可乐定计， 不同时间中间精密度 RSD值为 0.40%，不同人员中间精密度 RSD值为 1.27%， 不同仪器中间精密度 RSD值为 0.44%。表明该方法中间精密度良好。

2.8 回收率试验 取盐酸可乐定对照品贮备液(123.4 μg/mL)，用 0.1 mol/L的盐酸溶液分别稀释成质量浓度为 0.987、 1.234、 1.481 μg/mL的对照品溶液；精密称取珍菊降压片阴性颗粒细粉(缺盐酸可乐定)9 份， 每份 0.25 g， 精密称定，分别置磨口三角烧瓶中，设高、中、低3种加入量， 分别精密加入 0.987、 1.234、 1.481 μg/mL对照品溶液 25 mL， 按 “2.1.2” 项方法制备供试品溶液， 依法测定。 平均回收率为 96.37%， RSD值为 0.18%， 表明该方法准确度良好。 结果见表 1。

表1 回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 样品测定 取 6 批上海雷允上药业生产的珍菊 降 压 片， 每 批 取 10 片， 编 号 1 ～10， 按“2.1.2” 项制备供试品溶液， 依法测定每片中的盐酸可乐定， 并按 《中国药典》 2010 年版二部附录 X E项下规定计算含量均匀度。 结果见表2。

表2 6批珍菊降压片中盐酸可乐定测定结果及其含量均匀度计算 （%）Tab.2 Results of content uniform ity determ ination of six batches of Zhenju Jiangya Tablets（ %）

表 2 中批号 101031、 101124、 110406 为老工艺样品， 批号 120309、 120310、 120311 为改进后的新工艺样品。《中国药典》 规定含量均匀度限度标准为不超过15， 3 批老工艺样品含量均匀度数值偏大， 其中批号 101124 已超过限度，不符合规定；3批新工艺样品含量均匀度均符合规定，且数值较小，说明新工艺较好地解决了原工艺的含量均匀度问题。

3 讨论

3.1 样品破碎方法的考察 在珍菊降压片含量均匀度测定的文献报道中，有采用玻璃棒捣碎的方法进行样品破碎的， 该法费时费力，可操作性差［8］；有将药片置溶剂中直接超声溶解，但由于药片中黏性成分的影响，需要长时间超声才能完成，给测定结果带来不确定因素［13］。 本实验采用加入玻璃珠，在震荡器上震荡破碎的方法进行样品前处理，对玻璃珠用量、破碎时间等进行了优化，使方法更加简便快捷，易于操作。

3.2 含量均匀度代替成分定量测定的探讨 成分定量测定采用一定数量的样品研碎后取样测定，含量均匀度测定则是直接对10片样品分别进行测定，再根据测定结果进行含量均匀度计算，从两种方法的原理来看，含量均匀度既能反应目标成分在样品的分布情况，又能给出准确的含有量结果，在微量制剂的质量控制中更有意义。因此在多组分复方制剂的质量控制中可以考虑采用含量均匀度测定后得到的成分平均含有量代替成分定量测定结果，在充分保证各指标成分质量可控的前提下，适当缩减检测项目，降低检测工作量，节省检测成本。

3.3 含量均匀度的改进 珍菊降压片在生产中采用一步制粒工艺，由于处方中盐酸可乐定用量极低，生产控制比较困难，极易出现含量和含量均匀度问题。为解决含量均匀度问题，对制粒工艺进行了局部改进，新工艺调整了物料加入顺序，在不改变处方，不增加成本的情况下显著改善了产品含量均匀性，使产品的批间质量更加稳定。新工艺的改进兼顾了产品质量和成本效益，对保证临床用药安全具有重要意义，具有良好的应用价值。

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Uniform ity of dosage units of clonidine hydrochloride in Zhenju Jiangya Tablets by SPE-HPLC

QIAN Guo-hua1， ZHANGMeng-ling1， XU ling-ling2， JING Ying-chun1*
(1.Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co.， Ltd， Shanghai201401， China； 2.Shanghai University of TCM， Shanghai 201203， China)

Zhenju Jiangya Tablets； clonidine hydrochloride； solid phase extraction； HPLC；contentuniformity

R944

:A

:1001-1528(2014)02-0321-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.023

2013-07-12

上海市科学技术委员会中药现代化专项 (09DZ1977300)

钱国华 (1960—) ， 男， 工程师。 研究方向: 中药新药。 Tel:(021)64275618， E-mail:ghqian@shlys.com

*通 信 作 者: 敬 应 春 (1979 —) ， 男， 硕 士， 高 级 工 程 师。 研 究 方 向: 中 药 新 药。 Tel:(021)37565589， E-mail:jorgyingchun @163.com