Box-Behnken实验设计优化党参的闪式提取工艺

杨炳川， 方应权， 谢仲德

（重庆三峡医药高等专科学校， 重庆 404020）

Box-Behnken实验设计优化党参的闪式提取工艺

杨炳川， 方应权*， 谢仲德

（重庆三峡医药高等专科学校， 重庆 404020）

目的 建立和优化党参炔苷的闪式提取工艺。 方法 采用 Box-Behnken 实验设计， 结合响应面法， 以党参炔苷得率为指标考察影响闪式提取的主要因素， 选择最佳工艺条件。 结果 闪式提取的最佳工艺为： 120 V工作电压， 以16 倍 （V/m） 78%乙醇提取时间 128 s。 在上述条件下， 党参炔苷平均得率为 0.090 3%， 这一结果与模型预测值符合。结论 闪式提取法操作简便，节能高效，可用于党参炔苷的提取。

闪式提取；党参；党参炔苷；实验设计

党 参 为 桔 梗 科 植 物 党 参 Codonopsis pilosula （ Franch.）Nannf.、 紫 花 党 参 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（ Nannf.） L.T.Shen 或川党参 （ Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根［1］。 巫溪古称大宁， 所产大宁党参属川党参［2］。党参性甘，平，归脾、肺经。具有健脾益肺，养血生津的功能［1］。 现代研究表明， 党参含糖类、 挥发油、 皂苷及聚炔类等多种化合物，具有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、 增强造血功能等作用［3-5］。 党参炔苷 （ lobetyolin） 为党参的活性成分， 对乙醇造成的胃黏膜损伤具有很好的保护作用。不同产地的党参均含有党参炔苷，而与党参配伍的中药中未检测到党参炔苷，因此党参炔苷具有很好的专属性和特征性，可作为党参药材的特征指标成分［5-7］。 党参炔苷常用提取方法有渗漉法、 乙醇回流法和超声提取法等［8-9］。 闪式提取法是一种操作简便， 节能高效的提取方法［10-11］， 本研究首次以 闪式提取法提取大宁党参中的炔苷， 并以党参炔苷得率为指标， 采用 Box-Behnken 设计-响应面法优化提取工艺，为合理开发大宁党参提供实验依据。

1 仪器与材料

JHBE-50S 型中草药闪式提取器 （西安太康生物科技有限公司）； Agilent1100 系列高效液相色谱仪； RE 52—86A旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）； SB 3200-超声波提取器（上海必能信超声有限公司）； 超纯水仪 （上海优普纯水公司）； RE 52—86A旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）；Sartorius BS110S 分析天平 （ 北京赛多利天平有限公司） 。

大宁党参 （产地： 巫溪县夏布坪）， 由三峡中药研究所付绍智教授鉴定为 Codonopsis tangshen Oliv.的根， 除去杂质， 洗净， 干燥， 备用［2］； 党参炔苷对照品 （ 上海中药标准化研究中心， 纯度 ＞98%）； 乙腈为色谱纯； 其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大宁党参中党参炔苷的闪式提取工艺 取干燥党参粉碎制成粗粉 （20 目）， 精密称取20 g粗粉置闪式提取罐内，加入一定量的乙醇溶液提取， 工作电压为 120 V。 提取液滤过，用旋转蒸发仪将提取液挥干溶剂，即得。闪式提取过程中的提取时间、乙醇体积分数和用量根据具体实验安排而定。

2.2 大宁党参炔苷的测定方法 根据文献方法［5，12］， 采用高效液相色谱 -紫外检测法 （HPLC-UV） 测定党参药材和提取物中党参炔苷的含有量。

色谱条件为色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6mm， 5 μm）； 以乙腈-0.01%三氟乙酸 （20 ∶80） 为流动相； 体积流量为1.0mL/min； 柱温为 30 ℃， 检测波长为267 nm； 进样量 20 μL。 党参炔苷进样量 （X） 在 0.16 ～3.20 μg内与峰面积 （Y） 呈线性关系， Y=112 176X+ 84 587 （r=0.999 9）， 日内和日间相对标准偏差 （RSD）均小于 2%， 党参炔苷的平均回收率为 97.42%， RSD为1.42%， 供试品溶液在 12 h 内保持稳定。

2.3 Box-Behnken 实验设计及响应面分析

2.3.1 Box-Behnken 设计实验方案和结果 根据预试验结果，选取影响闪式提取工艺的三个因素，即提取时间（x1）、 乙醇体积分数 （x2） 和液料比 （x3） 为考察因素，根据 Box-Behnken 设计原理， 各因素设置 3 水平， 编码为-， 0， +， 各因素和水平编码及实际值见表 1， 根据实验方案，每个实验重复3次，测定并计算党参炔苷得率，以得率平均值为指标 （Y）， 实验方案和结果见表2。

表 1 Box-Behnken设计因素和水平

表 2 Box-Behnken设计结果

2.3.2 模型拟合与分 析 采 用 Design Expert 7.0.0 （ Stat-Ease Inc.Minneapolis） 软件 对 考 察指标 （ Y） 和 3 个考察因素 （x1、 x2、 x3） 进行回归分析， 结果显示指标和因素之间符合二次二项式模型 （P=0.000 1）， 模型的失拟（ lack of fit） 检验显示 失 拟呈非显 著 意义 （ P=0.749 4），表明模型拟合度高。对模型、一次项、二次项和交互项进行方差分析 （表3）。 结果可见， 各因素的一次项 （主要作用） 对提取得率的影响均呈统计学极显著意义 （P＜0.01）， 比较 F值可见， 主次顺序为： 液料比 ＞乙醇体积分数＞提取时间。乙醇体积分数和液料比的交互作用项（x2x3） 呈极显著意义 （P=0.001 3）， 其余交换项对提取得率影响不显著 （P＞0.05）。 各因素的二次项对闪式提取得率均呈现统计学显著意义 （P＜0.05）。

表 3 Box-Behnken实验设计方差分析

在 P＜0.1 水平上拒绝无显著相关的项目， 简化方程，得指标与因素的模型方程为：

Y=-2.957+4.638 ×10-3x1+0.059 59x2+0.037 23x3-5.475 ×10-4x2x3-1.745 ×10-5-3.163+4.198 × 10-4

方差分析 显 示， 模 型 P＜0.000 1， 具有极显著意 义，校正决定系数=0.946 6， 表明该方程拟合程度好，失拟检验 P值为 0.895 0， 可见模型失拟不显著［13］。

利用上述方程并结合 Design Expert 7.0.0 软件整合计算渴求函数 （ desirability function） 的 功能， 设各 因素权重为1， 得到考 察指标 （Y）、 即党参 炔 苷 得率极值为0.090 8%， 各因素水平分别为： 提取时间 （x1） 128 s， 乙醇体积分数 （x2） 78%， 液料比 （x3） 16， 以此作为闪式提取法提取大宁党参中党参炔苷的最佳工艺条件。

2.3.3 验证最佳工艺条件 取大宁党参粗粉 20 g， 按确定的最佳工艺闪式提取党参炔苷， 按 “2.2” 项下条件测定， 平行操作3 份， 党参炔苷得率平均值为 （0.090 3 ±0.003 7） %， 与模型预测值的偏差为 -0.55%。 可见模型预测性好， 确定的工艺具备可操作性和重复性。

2.4 与其他提取方法的比较 取同一批大宁党参样品， 根据文献方法［8-9］， 采用超声提取法和渗漉法提取大宁党参中的炔苷，每种方法重复3次，与本研究确定的闪式提取法相比较，结果见表4。

表4 提取方法比较

3 讨论

Box-Behnken 设计 （BBD） 近年来在中药提取、 制备和分析中应用日益广泛［14-15］。 本 研究建立了闪式提取法提取大宁党参中党参炔苷的方法， 采用 Box-Behnken 设计考察影响提取得率的主要因素：提取时间、乙醇体积分数和液料比，党参炔苷得率与考察因素之间符合二次二项式模型，通过响应面分析和渴求函数求极值的方法，确定了闪式提取的最佳工艺条件为将党参药材制成粗粉， 工作电压 120 V， 16 倍量 （V/m） 75%乙醇提取 128 s， 模型预测得率为0.090 8%， 实际值为0.090 3%， 模型预测良好， 工艺条件操作性和重复性好。测定了上述工艺条件下党参炔苷转移率， 转移率为 86.51%， 说明提取基本完全。 计算公式为：

转移率 = （提取液中成分量/药材中成分量） ×100%

研究中发现，随着提取时间延长，党参炔苷的得率先增大后减小，其原因可能是因为党参炔苷结构中含有炔键［8］， 在闪式提取高速剪切和搅拌［11］的条件下可能发生加成、氧化等反应，导致得率反而下降。而乙醇体积分数增大时也存在同样的情况，党参炔苷得率先增大后减小。在考察范围内，党参炔苷得率随着液料比的增大而增大，但预试验发现当液料比超过16 ∶1时， 提取物中的杂质明显增多，且液料比增大也会直接导致溶剂消耗量增大，因此设定液料比的考察范围为8 ～16 倍。

比较各种提取方法 （表4）， 渗漉法、 超声法和闪式提取法得率相近，但渗漉法和超声提取法时，药材分别需要48 h 和 12 h 的浸泡过程， 在时间上远超过闪提法的 128 s。乙醇用量上， V渗漉法∶V超声法∶V闪提法=0.52 ∶1.2 ∶1。 可见闪提法操作时间短，提取效率与传统方法相当，可用作提取党参中的党参炔苷。

［ 1 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典： 2010 年版一部［S］ 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 264-265.

［ 2 ］ 陈永春.大宁党参规范化栽培技术［J］.中国农技推广，2007， 23（12）： 27-28.

［3］ 刘福青.党参合剂对急性心肌缺血大鼠血液流变学的影响［J］.中成药， 2013， 35（6）： 1152-1154.

［4］ 段琦梅，梁宗锁，杨东风，等.黄芪、党参乙醇提取物抗菌活性研究［J］.中成药， 2012， 34（11）： 2220-2222.

［5］ 段琦梅，梁宗锁，杨东风，等.党参质量评价体系的建立及不同产地党参质量差异性分析［ J］.中草药， 2012， 34（11）： 995-999.

［6］ 赵晓华，刘养清，王润生，等.党参不同部位中党参炔苷的 RP-HPLC分析［ J］ .中成药， 2007， 29（7） ： 1046-1047.

［7］ 冯佩佩，李忠祥，原 忠.党参属药用植物化学成分和药理研究进展［ J］.沈阳药科大学学 报， 2012， 29 （4）：307-311.

［8］ 陈 璐，王天志，杨 兵，等.比较和优化党参炔苷的提取工艺［J］.华西药学杂志， 2008， 23（4）： 454-455.

［9］ 冯 月，吴文夫，魏建华，等.正交设计优化党参炔苷提取工艺的研究［ J］ .人参研究， 2013， 25（2） ： 46-48.

［10］ 谢仲德， 李文烈， 方应权， 等.白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究［J］.中成药， 2013， 35（9）： 2037-2039.

［11］ 方应权.紫花大叶柴胡中柴胡皂苷 a的闪式提取工艺研究［J］.中成药， 2013， 35（12）： 2614-2616.

［12］ 韩 雪， 刘养清， 王富乾， 等.RP-HPLC测定生脉饮（党参方） 中党参炔苷的含量［J］.中成药， 2008， 30（5）： 附4-附 6.

［13 ］ Elmizadeha H， KhanmohammadiaM， Ghasemia K， etal.Preparation and optimization of chitosan nanoparticles and magnetic chitosan nanoparticles as delivery systems using Box-Behnken statistical design［ J］ .JPharm Biomed， 2013， 80： 141-146.

［14］ 王桂玲， 房建强， 边书芹， 等.半枝莲中总生物碱的提取及抑菌作用的初步研究［ J］.中成 药， 2013， 35 （6）：1315-1319.

［15］ 沈 熊， 陆继伟， 梁 健， 等.应用质量源于设计理念优化大鼠血浆中大黄蒽醌的分析方法［J］.色谱， 2013， 31（6）： 561-566.

R284.2

： B

： 1001-1528（2014）05-1074-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.045

2013-10-14

重庆市教委自然科学基金项目 （kt121805）

杨炳川 （1956—）， 男， 副主任药师。 研究方向： 天然药物成分提取分离。 Tel： 13709440178

*通信作者： 方应权 （1973—） ， 男， 硕士， 副教授。 研究方向： 中药开发。 Tel： （0433） 58153404， E-mail： 862120258@qq.com