黄药子质量标准研究

李德斌， 黄志芳， 刘云华， 刘玉红， 陈 燕， 易进海*

（1.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；2.成都中医药大学，四川 成都 611137）

黄药子质量标准研究

李德斌1，2， 黄志芳1， 刘云华1， 刘玉红1， 陈 燕1， 易进海1*

（1.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；2.成都中医药大学，四川 成都 611137）

目的 建立黄药子的质量标准。方法 采用薄层色谱法对黄药子中黄独素B进行定性研究；采用高效液相色谱方法定量检测黄独素 B， 选用 ZORBAX Eclipse XDB C18柱 （4.6mm×150 mm， 5 μm） ； 柱温为 35 ℃； 流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 （32 ∶68）； 体积流量 1.0mL/min； 检测波长为 210 nm； 依据 《中国药典》 2010 年版方法对黄药子进行水分、 总灰分等各项检查。 结果 黄药子药材中水分 10.5% ～13.2%， 总灰分 2.22% ～4.02%， 酸不溶性灰分0.08% ～0.63%， 醇溶性浸出物含有量7.6% ～12.9%； 饮片中水分8.1% ～11.7%， 总灰分2.78% ～3.84%， 酸不溶性灰分 0.06% ～0.53%， 醇溶性浸出物含有量 6.9% ～12.0%； 薄层鉴别专属性强； 黄药子药材和饮片中黄独素 B含有量在 0.15% ～0.48%范围内。 黄独素 B在进样量 0.155 36 ～1.553 6 μg（r=0.999 9） 范围内具有良好的线性关系，平均回收率为 100.26% （RSD=1.47%）。 结论 本方法可靠、 准确、 专属性强， 可作为黄药子的质量控制方法。

黄药子；黄独素B；质量标准；薄层色谱；高效液相色谱

黄药子为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbifera L.的干燥块茎［1-3］，具 有散结 消瘿、 清热解 毒、 凉血止血之功效。用于瘿瘤痰核，癥瘕痞块，疮疡肿毒，咽喉肿痛，吐血，衄血，咯血，毒蛇咬伤［4-7］。黄药子主要生物 活性物质为其所含 的二萜内酯类成分，主要有 diosbulbins A-H （黄独素 AH）［8］。 研究表明， 黄独素 B具有抗肿瘤、 抗炎的药理活性，但也很可能是诱导肝毒性的主要毒性成分［9］，因此有必要对其制定限量范围。黄药子曾收载于 《中国药典》 1963 年版一部、 卫生部药品标准中药材第一册 （1992 年版）、 江苏省中药材标准 （1989 年版）、 四川省 中药材 标准 （1987 年版）、 广东省中药材标准 （2011 年版） 等， 但上述标准尚无成分定量测定和薄层鉴别等内容。本实验根据药典委下达的计划任务， 研究建立 TLC鉴别项、检查项、浸出物项和成分定量测定项等，进一步规范完善提高黄药子的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪 （ 美国安捷伦科技 有 限 公 司）； KQ-100 超 声 波 清 洗 仪（昆山市超声仪器有限公司）； AUW220D型十万分之一电子天平 （ 日本岛津）； Sigma3K15 高速冷冻离心机 （德国 Sigma）； Milli-Q Integral 3 超纯水机（Millipore）。

1.2 试 药 黄 独素 B对照品 （批号： MUST-10101311） 购自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇 为 美 国 Fisher色 谱 纯， 水 为 超 纯 水， 其 他试剂均为分析纯。本实验收集到不同批次的黄药子药材 10批和饮片 6批， 经鉴定为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbifera L.的 干燥 块 茎 的 炮 制加工品。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别 取本品粉末 0.5 g，加甲醇 5 mL，超声处理 20 min， 滤过， 滤液作为供试品溶液。 另取黄独素 B对照品， 加甲醇制成每 1 m L含 0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述供试品溶液10 μL和对照品溶液 5 μL， 分别点于同一硅胶 G薄层板上，分别以三氯甲烷-甲醇 （20 ∶1） 和正丁醇-冰醋酸-水 （4 ∶1 ∶5） 的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，加热至斑点显色清晰。上述两种展开系统均能得到较好的色谱分离，色谱斑点清晰，以前者为佳。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，试验表明该鉴别方法专属性强，重复性好，准确、 灵敏、 可行。 见图1和图2。

图1 黄药子药材薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram of raw medicinal

图2 黄药子饮片薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of herbal pieces

2.2 水分测定 照 《中国药典》 2010 年版一部附录Ⅸ H水分测定法第一法 （ 烘干法） 测定［10］。 黄药子药材中水分幅度范围为 10.5% ～13.2%， 黄药子饮片中水分幅度范围为 8.1% ～11.7%， 故暂定黄药子药材中水分不得过 15.0%， 黄药子饮片中水分不得过 13.0%。

2.3 浸出物测定 照 《中国药典》 2010 年版一部附录X A浸出物测定法 （醇溶性浸出物测定法）项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂。黄药子药材和饮片中醇溶性浸出物的含有量幅度范围分别为7.6%～12.9%和6.9% ～12.0%， 故暂定黄药子药材醇溶性浸出物的量不得少于 5.0%， 黄药子饮片中醇溶性浸出物的量亦不得少于 5.0%。

2.4 总灰分和酸不溶性灰分 照 《中国药典》2010 年版一部附录Ⅸ K灰分测定法测定。 黄药子药材中总灰分幅度范围为 2.22% ～4.02%， 酸不溶性灰分幅度范围为 0.08% ～0.63%， 故暂定黄药子药材总灰分不得过 5.0%， 酸不溶性灰分不得过1.0%。 黄药子饮片中总灰分幅度范围为 2.78% ～3.84%， 酸 不 溶 性 灰 分 幅 度 范 围 为 0.06% ～0.53%， 故暂 定 黄 药 子 饮 片 中 总 灰 分 不 得 过5.0%， 酸不溶性灰分不得过 1.0%。

2.5 黄独素 B测定

2.5.1 色谱 条 件 ZORBAX Eclipse XDB C18色谱 柱 （4.6 mm ×150 mm， 5 μm）； 柱 温 为35 ℃； 流动 相 为 甲 醇-0.1% 磷 酸 （ 32 ∶68 ） ；体积流 量1.0 m L/min； 进 样 量 为 5 μL； 检测 波长为 210 nm。 对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图 3、 图 4。

图3 黄独素 B对照品 HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram of reference of diosbu lbins B

2.5.2 对照品溶液的制备 精密称取黄独素 B对照品适量， 加甲醇制成每1 mL含黄独素 B 0.15 mg的溶液，即得。

图4 黄药子样品 HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatogram of sample of Dioscorea bulbifera L.

2.5.3 供试品溶液的制备 取本品粉末 （过三号筛） 约1 g，精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇 50 m L， 称定质量， 加热回流 1 h， 放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过， 精密量取续滤液 25 mL， 蒸干， 残渣加水20 mL溶解转入分液漏斗中， 用三氯甲烷振摇提取3 次， 每次20 mL， 合并三氯甲烷液， 蒸干， 残渣加甲醇溶解并定容至 10 mL量瓶中， 摇匀， 滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 注入液相色谱仪中， 以进样量 （μg） 为横坐标， 对照品峰面积 （A） 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程： Y=904.47X-0.17 （r=0.999 9）。 黄 独 素 B 在 0.155 36 ～1.553 6 μg范围内具有良好的线性关系。

2.5.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液 5 μL，注入液相色谱仪，测定黄独素B的峰面积，重复6次， 结果黄独素 B峰面积的 RSD为 0.44%， 表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性 试验 精密吸 取供试品 溶 液 5 μL， 在相应色谱条件下于 0、 2、4、 6、12、 24 h分别进样，测定黄独素B的峰面积，结果峰面积 RSD为 0.42%， 表明供试品于 24 h 内测定结果稳定。

2.5.7 重复性试验 照 “2.5.3” 项供试品溶液的制备下操作， 对同一批药材样品 （2#） 进行多次测定，计算，得黄独素 B的平均含有量为0.329 5%， RSD为 0.63%， 表 明 该 方 法重 复 性良好。

2.5.8 加样回收率试验 取已知黄独素 B量的黄药子药材 （2#） 0.5 g， 精密称定， 准确加入黄独素 B对照品溶液 （0.388 4 mg/mL） 4.2 mL， 照“2.5.3” 项供试品溶液的制备操作，测定，计算回收率，平均回收率为 100.26%， RSD为 1.47%。结果见表1。

表1 加样回收率试验Tab.1 Results of recovery tests

2.5.9 样品测定 按照上述黄独素 B的 HPLC测定条件和方法， 对 16 批黄药子药材和饮片进行了测定，再根据相应药材和饮片的含水量，换算成以干燥品计算含黄独素B的量，结果见表2。 由表2可见，黄药子药材和饮片中黄独素B的幅度范围为 0.15% ～0.48%， 差异不大。 故暂定本品按干燥 品 计 算， 含 黄 独 素 B （C19H20O6） 不 得 超 出0.15% ～0.50%范围。

表 2 16 批不同产地黄药子药材及饮片样品Tab.2 Sixteen batches of Dioscorea bu lbifera L.from different habitats

3 讨论

3.1 薄层鉴别 黄药子目前还没有法定对照药材提供， 故未采用以黄药子对照药材为对照进行 TLC鉴别。 黄药子主要代表性的毒/效成分——黄独素B对照品可从市场上多家公司买到，故以黄独素B对照品为对照进行 TLC鉴别。

3.2 方法学考查 参照文献 ［11-12］， 以甲醇作为提取溶剂，对黄药子常规提取方法进行比较研究。结果甲醇加热回流1 h和2 h提取效果相当，均优于超声提取， 故选择甲醇加热回流1 h。 采用3 根不同商品规格的 C18色谱柱 （ ZORBAX Eclipse XDB C18、 SUPELCO Discovery C18、 Phenomenex Luna C18） 对同一批药材 （2#）样品进行测定， 计算黄独素 B含有量相对标准偏差， 结果 RSD为1.21%。 对流动相的组成与比例进行了比较、 筛选。 经比较研究， 最终确定甲醇-0.1%磷酸 （32 ∶68） 为分离黄独素 B色谱条件的流动相。 吸取黄独素 B对照品溶液和供试品溶液各 5 μL， 注入液相色谱仪，由结果知黄独素B的最大吸收波长为210 nm， 故确定检测波长为 λ=210 nm。 在上述色谱条件下，供试品色谱中黄独素B为单一色谱峰，与其他杂质峰达到基线分离。

3.3 成分定量测定 成分定量测定是药品标准中较为重要的项目，限度指标不仅是控制这种成分的量，更重要的是反映此药品制备工艺是否规范，只有使用合格的药材饮片通过规范的制备工艺才能达到的。限度指标规定的太低，则使用不合格的药材饮片或偷工减料就可以达到规定的限度成为可能，因此，定量测定规定的限度值必须合理，以达到对药品质量监控的目的。考虑到黄独素B为黄药子毒效成分的主要代表，本实验规定含黄独素 B（C19H20O6） 不得超出 0.15% ～0.50%范围。 成分含有量过低药材不合格，过高导致毒性增大，临床应用可控性减小。

［ 1 ］ 徐增莱， 丁志遵.黄药子的研究概况［J］.中草药， 1998，29（2）： 125-127.

［ 2］ 江苏中医学院.中药大辞典： 下册［M］.上海： 上海科学技术出版社， 1977： 2059-2061.

［ 3 ］ 湖南中医药研究所.湖南药物志： 第 1 辑［M］.长沙： 湖南省人民出版社， 1970： 679.

［ 4 ］ 张海谋， 袁金玉.黄药子的药理和毒理研究进展［J］.医药导报， 2009， 28（4）： 490-492.

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［ 7 ］ Wang J， Liang Q， Ji L， et al.Gender-related difference in liver injury induced by Dioscorea bulbifera L.rhizome in mice［J］ .Hum Exp Toxicol， 2011， 30（9）： 1333-1341.

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Quality standard for Dioscorea bulbifera L.

LIDe-bin1，2， HUANG Zhi-fang1， LIU Yun-hua1， LIU Yu-hong1， CHEN Yan1， YI Jin-hai1*
（1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， China； 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

Diosocorea bulbifera L.； diosbulbins B； quality standards； TLC； HPLC

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-1037-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.033

2013-06-18

2015 版中国药典科研计划

李德斌 （1987—） ， 男， 硕士生， 从事中药化学成分与质量标准。 Tel： 15928127934， E-mail： 396917203@qq.com

*通信作者： 易进海 （1963—） ， 男， 研究员， 从事中药化学成分与质量评价。 Tel： （028） 85210843， E-mail： yijinhai63@163.com