舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法

郭玉东， 胡宇驰， 曹春然， 王志斌*， 周建平， 左泽平， 高 阳， 王碧松

（1.北京市药品检验所， 北京 100035； 2.北京中医药大学中药药理系， 北京 100102）

舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法

郭玉东1， 胡宇驰1， 曹春然1， 王志斌1*， 周建平1， 左泽平1， 高 阳2， 王碧松1

（1.北京市药品检验所， 北京 100035； 2.北京中医药大学中药药理系， 北京 100102）

目的 建立舒血宁注射液 （银杏叶提取物） 体外抑制血小板聚集的生物活性测定法用于补充其质量控制方法。方法 以抑制家兔血小板聚集作用来考察显示舒血宁注射液量效关系和效价测定。结果 舒血宁注射液对凝血酶和胶原诱导的血小板聚集无明显的抑制作用， 效价测定为 100 U/mL。 结论 舒血宁注射液抑制血小板聚集的生物活性测定法可靠，重复性良好，稳定性较好，可作为质量控制。

舒血宁注射液；血小板聚集；生物活性测定法；质量控制

舒血宁注射液为银杏叶提取物制剂，通过长期的研究，药理机制和临床应用都得到了广泛认可、全面认识和深入研究。 北京市药品检验所在 2009年国家中药注射剂评价性抽验中，发现不同生产企业的舒血宁注射液质量存在差异，表明现行的质量控制方法存在一定缺陷。金纳多注射液与舒血宁注射液主要成分相同，仅生产工艺有所差异，在本研究中作为对照。

中药成分复杂，而单一的控制少数指标性成分难以控制药物的有效性和安全性，这就迫使我们对现有的中药质量控制方法进行改进［1］。 生物检定法最近几年日趋成熟，并且在某些西药质量控制中生物检定法已经占据了主导地位， 《中国药典》2010 年版一部中， 增加了中药的生物活性测定研究指导原则［3］， 说明在中药尤其是中药注射剂质量标准中增订生物活性测定项，已经是一种方向［2］。 如果能够率先在质量标准中制定生物活性测定项，必将大大推动中药的发展，使其有质的飞跃。因此生物活性测定法用于中药质量控制已是一种必然的趋势。

前期药效学研究发现舒血宁注射在体内外对血小板聚集均具有较好的抑制作用，并且具有明确的剂量依赖关系，因此本实验尝试建立舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法，量化舒血宁注射液的活血化瘀作用，对其质量控制方法进行补充，更好的指导舒血宁注射液的临床使用。

1 实验材料

1.1 实验动物 普通级日本大耳白家兔， 许可证号 SCXK （ 京）2006-0009，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 实验试剂 5 μmol/L二磷酸腺苷 （ADP， 北京世帝科学仪器公司）； 凝血酶 （中国药品生物制品检定所），批号 140605-200824； 血小板活化因子 （PAF） （ACROS），批号 A0208208001； 0.9%氯化钠注射液 （中国大冢制药有限公司）， 批号0B72H2； 枸橼酸纳 （北京化学试剂公司）， 批号20080904； 灭菌注射用水 （大同市惠达药业有限责任公司），批号 0907261。 金纳多注射液 （5mL/支）， 批号 D2118； 舒血宁注射液 （5 m L/支）， 批号 100707。

1.3 实验仪器 LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集凝血因子分析仪 （北京世帝科学仪器公司）， DT5-1 离心机 （北京时代北利离心机有限公司）， MEK-6318 血液分析仪 （北京健长医疗器械有限公司）。

2 实验方法

2.1 血浆制备 家兔采取颈总动脉放血 75 mL，加 3.8%枸橼酸纳 （1 ∶9） 抗凝， 1 000 r/min 离心10 min 制备富血小板血浆 （PRP）， 剩余血样继续3 500 r/min 离 心 10 min 制 备 贫 血 小 板 血 浆（PPP）。

用血液分析仪测定 PPP和 PRP中的血小板数，PPP中血小板数一般在 5 ×109个/L以下， 利用PPP调节 PRP中的血小板数在 4.0 ×1012～4.5 × 1012个 /L之间［4］，为保证测量的准确性， 血小板聚集的测定应在4 h 内完成， 且PRP不可冷冻保存和过度震荡［5］。

2.2 测试样品配制 取金纳多注射液 1 支，用0.9%的生理盐水分别配制成剂间比为 0.85， 配制梯度为 85%、 72%、 61%、 52%、 44%的样品液各1 mL， 作为对照品， 取舒血宁注射液 1 支， 用0.9%的生理盐水分别配制剂间比为 0.85， 配制梯度为 85%、 72%、61%、 52%、 44%的样品液各1 m L， 为供试品。

2.3 血小板聚集测定 取 PPP 210 μL加入测试杯， 进行仪器调零。 再取 PRP180 μL［6-7］， 分别加入不同质 量分数 的 样 品 液 20 μL，37 ℃ 孵 育 180 s［8］， 分别加入聚集诱导剂 10 μL， 测定 5 min内的最大聚集率［9］。

2.4 舒血宁注射液生物活性测定

2.4.1 量效关系考察 取舒血宁、 金纳多注射液，用 0.9%氯化钠注射液精确稀释为含舒血宁、 金纳多注射液 44%、 52%、 61%、 72%、 85%和 100%（原液） 的 6个不同质量分数稀释液， 剂间比为0.85， 依 “2.3”项下方法，分别测定含药血浆的血小板最大聚集率。

2.4.2 效价测定 取金纳多注射液， 用 0.9%氯化钠注射液精确稀释为含金纳多注射液 72%、85%和 100% （原液） 的 3 个不同质量分数稀释液， 剂间比 0.85，作为对照品组 （S）； 取舒血宁注射液， 用 0.9%氯化钠注射液精确稀释为含舒血宁注射液72%、 85%和100% （原液） 的3 个不同质量分数稀释液， 剂间比 0.85， 作为供试品组（T）。依 “2.3” 项下方法， 分别测定对照品组和供试品组含药血浆的血小板最大聚集率。 按照 S1、T1、 T2、 S2、 S3、 T3 的顺序 （排除因 S 组和 T组测定的先后次序引起的误差）， 平行测定3次。 按《中国药典》 生物检定统计法中量反应平行线三三法进行统计学处理，考察结果的可靠性，计算T组的效价 （PT） 和可信限率 （FL%）。

3 实验结果与讨论

3.1 量效关系考察结果 由前期预试发现， 舒血宁注射液与金纳多注射液均对凝血酶和胶原诱导的血小板聚集无明显的抑制作用，因此实验中只选择ADP和 PAF两种诱导剂进行试验。 以对数转换后血小板最大聚集率为纵坐标，药物百分含有量为横坐标， 结果见表1 ～2。 由于血小板最大聚集率经对数转换后与药物百分含有量所成的线性关系，较不转换前线性更好，相关系数更高，因此考察线性关系和计算效价时均对血小板最大聚集率进行对数转换。

表1 舒血宁注射液对不同诱导剂诱导的血小板最大聚集率的影响Tab.1 Effect of Shuxuening Injection on platelet maximum aggregation rate induced by different inducers

表2 金纳多注射液对不同诱导剂诱导的血小板最大聚集率的影响Tab.2 Effect of Jinnaduo Injection on plateletmaximum aggregation rate induced by different inducers

由表1～2可以看出对于 ADP诱导的血小板聚集，舒血宁注射与金纳多注射液的抑制作用无明显差别， 对于 PAF诱导的血小板聚集， 金纳多注射液的抑制作用较强于舒血宁注射液。

对表1～2数据中药物浓度与对数转换后的血小板最大聚集率进行线性考察，发现舒血宁注射液与金纳多注射液对ADP和 PAF诱导的血小板聚集，均有较好的线性关系 （r2均大于 0.96）， 其中对于PAF诱导的聚集两种注射液所得线性关系更好， r2均大于0.99， 由此可见舒血宁注射液与金纳多注射液对ADP和 PAF诱导血小板聚集均有较好的抑制作用，并成剂量依赖性，随着药物浓度的增大，其抑制作用越强，血小板聚集率越低。

3.2 效价测定与可靠性考察 由于金纳多注射液在 《中国药典》 2010 年版及国外药典上未见效价的规定， 因此假设对照品 （S） 金纳多注射液的效价为 100 U/mL， 由于舒血宁注射液与金纳多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血宁注射液抑制血小板聚集的效果与金纳多相同，则其测得效价也应为 100 U/mL， 结果见表 3。

表3 舒血宁注射液由 ADP、 PAF诱导的测得效价与可信限率Tab.3 M easured titer and rate of confidence lim it of Shuxuening Injection induced by ADP and PAF

由表4和表5可靠性检验得，两种诱导剂诱导的血小板聚集可靠性检验均合格， 回归显著 （P＜0.01）， 偏离平行、 二次曲线、 反向二次曲线均不显著 （P＞0.05）， 可信限率均小于 10%， 以上结果表明该方法得到的测得效价可靠。其中舒血宁ADP诱导的测得效价与金纳多相差较小，且试品间可靠性检验无显著性差异 （P＞0.05）， 说明对于ADP诱导的血小板聚集， 舒血宁注射液的抑制作用与金纳多差别不明显。 舒血宁 PAF诱导的测得效价与金纳多相差较大，并比金纳多小，且试品间可靠性检验有显著性差异 （P＜0.01），进一步验证了对于 PAF诱导的血小板聚集， 金纳多注射液的抑制作用强于舒血宁注射液。由以上结果可以看出，虽然舒血宁注射液与金纳多注射液主要成分含有量相同，但测得效价却不相同，说明两种注射剂质量存在一定差异。

表4 舒血宁注射液由 ADP诱导效价测定的可靠性检验结果Tab.4 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by ADP

表5 舒血宁注射液由 PAF诱导效价测定的可靠性检验结果Tab.5 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by PAF

3.3 重复性考察 取同一血浆为试验系， 按照血小板聚集的测定方法，测定舒血宁注射液相对金纳多注射液相对生物效价，重复测定6次，并进行可靠性检验，结果见表6 ～7。

由表 6 ～7 可见，舒血宁注射液经 ADP、 PAF诱导的血小板聚集的相对生物效价，6次分别测定结果的可靠性检验均合格， 回归显著 （P＜0.01），偏离平行、二次曲线、反向二次曲线均不显著（P＞0.05），可信限率均小于10%， 测得效价平均值的 RSD均小于5%， 因此说明用血小板聚集的方法测定出舒血宁注射液的生物效价方法可靠，重复性较好，具有一定的可行性。

表6 舒血宁注射液对 ADP诱导血小板聚集的相对生物效价重复性考察Tab.6 Relative biological titer reproducibility of platelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by ADP

表7 舒血宁注射液对 PAF诱导血小板聚集的相对生物效价重复性考察Tab.7 Relative biological titer reproducibility of p latelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by PAF

4 结论

由上述结果可以看出， 舒血宁注射液对 ADP、PAF诱导的体外血小板聚集有较好的抑制作用， 并且剂量依赖性明显。通过线性关系考察发现，均具有良好的线性关系，可靠性检验均合格表明该方法得到的测得效价可靠。重复性考察表明，建立的两种诱导剂诱导体外血小板聚集的生物检定方法学，重复性较好，测定出舒血宁注射液的生物效价可靠，具有一定的可行性，可以进行深入的研究。

由于舒血宁注射液和金纳多注射液主要成分含有量相同，建立的舒血宁注射液的生物效价方法可靠，如果两种注射剂疗效相同，则测得效价应无差别，但实际测的效价差异较大，说明两种注射剂的质量存在一定差异，这也进一步说明单从成分控制舒血宁的质量存在缺陷，需要进一步提高。

目前中药生物活性测定法还处在起步阶段［10-11］， 该方法的关键 问题是 指标和对照品确立，由于目前舒血宁注射液还没有对照品，因此本实验选择与舒血宁注射液同质的金纳多注射液作为标准品，并假定其效价，测定舒血宁注射液的效价。如果能够建立一批针对抑制血小板聚集活性的舒血宁注射液 对照 品， 并通 过 协 作标 定［12-14］， 确 定 其 稳定性，必将极大的推进舒血宁注射液生物活性测定法进步，真正意义上量化其活性，规定合格范围，控制舒血宁注射液的质量。

测定体外血小板聚集实验时， 离心完的 PRP与 PPP血浆一定要用血液分析仪测定其血小板数，尽量保证每次实验 PRP血浆中的血小板数基本相同， 若 PRP中的血小板数过高， 可以用 PPP进行调节；过低时可降低离心的转速，以保证血小板数在合适范围内。制备好的血浆最好在4 h内完成测定，时间过长血浆的稳定性会下降。操作过程中避免过度震荡，过度震荡也会使血浆的稳定性下降，避免冷藏，低温会加速血小板聚集，以上操作均能使测量结果有较大的误差，操作过程中应当注意。

影响体外血小板聚集实验的因素较多，为了保证每次实验结果的准确性，应建立相应的标准操作规程，不同实验室均应按照此操作规程进行实验，使实验结果具有可比性，加快该方法在不同实验室的应用。

由于舒血宁注射液体外抗血小板聚集的实验操作简单、快速、准确、费用低，便于建立的生物活性测定方法［15］， 利于在药检部门推广。 该方法对舒血宁注射液的质量控制方法进行了很好的补充，使其质量控制方法更加完善，保证其临床使用的安全有效。由于活血化瘀类注射剂多具有抑制血小板聚集的作用，可以尝试着将这种方法在该类注射剂质量控制中应用，为中药质量控制方法提供新的思路。

［ 1］ 周海钧， 申蕴如.生物检定统计方法［M］.北京： 人民卫生出版社， 1988： 1-2.

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Bioassay m ethod of Shuxuening Injection to inhibit p latelet aggregation

GUO Yu-dong1， HU Yu-chi1， CAO Chun-ran1， WANG Zhi-bin1*， ZHOU Jian-ping1，ZUO Ze-ping1， GAO Yang2， WANG Bi-song1
（1.Beijing Institute for Drug Control， Beijing 100035， China； 2.Department of Chinese Herbal Pharmacology， Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100102， China）

AIM To establish a bioassaymethod of Shuxuening Injection （Ginko Folium） to inhibit the plateletaggregation for the supplementary of its quality control.METHODS The pharmacological activity of platelet aggregation of rabbit blood was used for the examination of dose-effect relationship and titer of Shuxuening Injection.RESULTS The inhibitory effect of Shuxuening Injection on platelet aggregation induced by thrombin and gelatin was not distinct，and the determined titer was 100 U/mL.CONCLUSION The bioassay method of platelet aggregation of Shuxuening Injection is reliable with good reproducibility and stability，and can serve as its quality control to some extent.

Shuxuening Injection； platelet aggregation； bioassaymethod； quality control

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-1008-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.027

2013-05-11

郭玉东 （1984—） ， 男， 主管药师， 硕士， 主要从事药品安全性评价试 验。 Tel： （010） 83288837， E-mail： guoyudong23@ 126.com

*通信作者： 王志斌， 研究员， 主要从事药品标准及药物活性研究。 Tel： （010） 83220757 ， E-mail： wangzhibin4804@sina.com