近红外光谱法高通量分析黄连上清丸的总体质量差异

陈 杨， 范 琦*， 王以武， 董艳虹， 吴阮琦， 李 娟

（1.重庆医科大学药学院， 重庆 400016； 2.重庆医科大学药学实验中心， 重庆 400016）

近红外光谱法高通量分析黄连上清丸的总体质量差异

陈 杨1， 范 琦1*， 王以武2， 董艳虹1， 吴阮琦1， 李 娟1

（1.重庆医科大学药学院， 重庆 400016； 2.重庆医科大学药学实验中心， 重庆 400016）

目的 建立高通量快速无损近红外光谱法分析黄连上清丸的总体质量差异。方法 取黄连上清丸浓缩水丸和普通水丸6个生产企业作为校正集和验证集。测量它们近红外漫反射光谱并采用主成分分析法计算得分进行判别分析，计算得分的协方差矩阵S进行广义方差分析。结果 建立黄连上清丸制剂类型及厂家的判别分析模型，校正集和验证集的正判率均为 100.0%； 广义方差模型计算广义方差值。 结论 近红外光谱法结合判别分析能够识别黄连上清丸的制剂类型及厂家；结合广义方差分析能够量化表征黄连上清丸的总体质量差异。

近红外光谱法；化学计量学；总体质量差异；黄连上清丸

黄连上清丸是我国常用的一种中成药，主要治疗因风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结和小便短赤。黄连上清丸由黄连、栀子等17味药材制成丸剂， 依据黏合剂不同分为水丸、水蜜丸和大蜜丸；其中，水丸又依据提取浓缩与否分为浓缩水丸 （concentrated and watered pill） 和普通水丸 （ common watered pill）［1］。 黄连上清丸的生产厂家众多，获准的品种规格多达两百余种。中药制剂，尤其是多厂家的中药复方制剂，常因药材产地、辅料、生产工艺、生产状态等不同使其总体质量差异较大，成为中药制剂发展的一个主要制约因素。因此，有必要对黄连上清丸的总体质量差异进行分析及控制。

目前，中药制剂总体质量差异的分析方法主要包括目视法、 核 磁共振指纹图谱法［2］、气相色谱指纹图谱法［3］和高效液相色谱指纹图 谱法［4-6］。 其中，目视法依据中药制剂的大小、颜色、表面特征等外观性状进行分析。但是，中药制剂的外观性状易于人为改变，且肉眼观察比较主观。核磁共振指纹图谱法使用有毒试剂，污染环境。气相色谱指纹图谱法和高效液相色谱指纹图谱法依据中药制剂所含数种物质成分的化学性质进行分析，未考虑其他成分及物理性质对中药制剂质量的影响，且因耗时、 破坏 样 品 而 不 宜 用 于 过 程 分 析［7-8］和 现 场 分析。因此，需要建立一种高通量快速无损的分析方法，为控制黄连上清丸的总体质量差异、加强监督管理、维护消费者及厂家的权益提供技术支持。

近红外光谱几乎可以获得含氢基团的全部信息。 这些信息来源于被测物质分子 C-H、 N-H、 OH等含氢基团振动的倍频与合频吸收。近红外光谱的信息丰富，谱带复杂。表现为很多官能团的倍频峰、合频峰叠加在一起形成很多宽的吸收谱带，且吸收系数低。因此，难以采用近红外光谱中某（些） 吸收谱带直接对样品进行分析。近红外光谱法 （near infrared spectroscopy， NIRS） 结合化学计量学技术 （ chemometric techniques），能够在特征谱段甚至全光谱范围内，找出被众多共性所掩盖的微弱特性，提取特征信息，建立充分反映光谱特征与待测特性之间关系的数学模型，实现复杂体系的高通量、 快速及无损分析［9-10］， 在中成药分析中日益得到重 视［11-13］。 本 实验 基 于 近红 外 漫 反射 光 谱法 （ near infrared diffuse reflectance spectroscopy，NIRDRS）， 应用化学计量学技术， 分析黄连上清丸的制剂类型间、厂间和批间的总体质量差异。

1 仪器与药品

1.1 仪器 AntarisⅡ傅立 叶变换 近红外 光谱仪（ 美国 Thermo Fisher Scientific） ， 配 备 铟 镓 砷 检 测器、 积分球附件和样品旋转杯， 控制软件为 RESULT 3.0。

1.2 药品 收集市售黄连上清丸样品共31 批，见表1。

2 方法与结果

2.1 近红外漫反射光谱测量

2.1.1 丸剂样品的近红外漫反射光谱测量 取同一批黄连上清丸样品适量，置样品旋转杯中，使样品填装高度约为 1.8 cm。 设置光谱测量参数： 扫描范围 9 999.1 ～3 799.1 cm-1， 分辨率 4 cm-1，扫描次数 64， 每次样品测量前测量并扣除背景。每个样品重复填装并测量 5 次［14］， 所得 155 张丸剂样品的近红外漫反射光谱见图1 （1-1）。

表1 黄连上清丸样品Tab.1 Sam p les of Huanglian Shangqing Pills

另使样品填装高度约为 1.1 cm， 用以上方法及参数测量各批丸剂样品的原始近红外漫反射光谱， 见图 1 （1-2）。

2.1.2 丸粉样品的近红外漫反射光谱测量 分别粉碎各批黄连上清丸样品，并使各批丸粉样品的粒度相近。 设置光谱测量参数： 扫描范围 10 001.0 ～3 799.1 cm-1，分辨率8 cm-1， 扫描次数 64， 每次样品测量前测量并扣除背景。 按 “2.1.1” 项方法测量得到 155 张丸粉样品的原始近红外漫反射光谱见图1 （2）。

图1 黄连上清丸样品的原始近红外漫反射光谱图Fig.1 Raw near in frared diffuse reflectance spectra for Huanglian Shangqing Pills

2.2 制剂类型间总体质量差异分析

2.2.1 判别分析 从浓缩水丸及普通水丸样品中各取14 批和10 批作为校正集， 其余为验证集。判别分析 （ discriminant analysis） 使用的建模软件为AntarisⅡ傅立叶变换近红外光谱仪配置的 TQ Analyst8.0 （美国 Thermo Fisher Scientific）， 软件自动选取的建模光谱范围为 9 875.7 ～3 922.5 cm-1，见图2 （1） 和 （2）。

图2 黄连上清丸浓缩水丸和普通水丸建模近红外光谱Fig.2 Near infrared diffuse reflectance spectra used in modeling for Huanglian Shangqing Pills of concentrated and watered pills and common watered pills

采用主成分分析法 （ principal component analysis） 对浓缩水丸及普通水丸样品的近红外光谱数据降维［15］， 部分建模光谱的前两个主成分的得分见表2。

表2 浓缩水丸和普通水丸部分建模光谱的前2个主成分的得分Tab.2 First two principal com ponent scores of partial modeling spectra for concentrated and watered pills and common watered pills

取前 2 个主成分 （ principal component） （第一主成分和第二主成分的贡献率分 别为 98.7% 和1.1%， 累积贡献率为99.8%） 的得分建立黄连上清丸制剂类型的判别分析模型，校正集和验证集的正判率均为 100.0%。 留一法交叉验证 （ leave-one-out cross-validation） 的正判率为 100.0%， 表明模型的稳定性良好。采用改变丸剂样品填装高度至约为1.1 cm时测得的近红外漫反射光谱数据进行分析， 正判率为 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 图 3 （1）显示浓缩水丸及普通水丸的校正样品各自聚集，表明黄连上清丸不同制剂类型间的总体质量存在显著差异。图中符号△和○表示相应的制剂类型。

采用丸粉样品的近红外光谱建立判别分析模型时， 建模光谱范围为 9 877.6 ～3 922.5 cm-1， 该光谱区域内浓缩水丸和普通水丸的近红外光谱见图2（3） 和 （4）。 前 2 个主成分 （贡献率分别为 96.6%和 3.1%， 累积贡献率为 99.7%） 的得分见表 2， 校正集、验证集和留一法交叉验证的正判率均为100.0%。 图 3 （2）显示校正样品的分析结果。

图3 黄连上清丸制剂类型判别分析的校正集结果图Fig.3 Plots for the discrim inant analysis models for the preparations of Huanglian Shangqing Pills in the calibration sets

上述结果表明，近红外光谱判别分析能够准确、直观地识别黄连上清丸的不同制剂类型；而近红外光谱广义方差分析能够量化表征黄连上清丸不同制剂类型间的差异大小。以上两个分析方法一起使用，能够同时定性、定量地表征黄连上清丸制剂类型间的总体质量差异。对于质量控制，宜使用未经处理的丸剂样品；但对于监督管理，使用丸粉样品能有效降低样品大小形态对分析的干扰。

2.3 厂间总体质量差异分析

2.3.1 判别分析

2.3.1.1 浓缩水丸 从厂 A和厂 B的样品中各取7批作为校正集，其余为验证集。软件自动选取的建模光谱范围为 9 875.7 ～3 922.5 cm-1， 见图 4（1） 和 （2）。

图4 黄连上清丸各厂样品建模近红外光谱Fig.4 Near infrared d iffuse reflectance spectra used in modeling for Huanglian Shangqing Pills from differentmanufacturers

采用主成分分析对厂A和厂B样品的近红外光谱数据降维。前6个主成分的贡献率分别为85.3%、 11.3%、3.1%、 0.1%、0.1%和 0.1%，累积贡献率为 100.0%， 相应的得分见表 3。

以前6个主成分的得分建立浓缩水丸的厂家判别分析模型，校正集和验证集的正判率均为100.0%。 留一法交叉验证的正判率为 100.0%，表明模型的稳定性良好。采用改变丸剂样品填装高度至约为 1.1 cm时测得的近红外漫反射光谱数据进行分析， 正判率为 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 图 5 （1）显示厂 A和厂 B的校正样品各自聚集，表明不同厂家浓缩水丸的总体质量存在显著差异。图中大写字母A和B表示相应的厂家。

图5 黄连上清丸厂家判别分析的校正集结果图Fig.5 Plots for the discrim inant analysismodels for the manufacturers of Huanglian Shangqing Pills in the calibration sets

表3 浓缩水丸部分建模光谱的前6个主成分得分Tab.3 First six principal components scores of partialmodeling spectra for concentrated and watered pills

2.3.1.2 普通水丸 从厂 C和厂 D的样品中各取3批作为校正集，厂E和厂F的各2批样品均作为校正集 （以实施留一法交叉验证）， 其余为验证集。 软件自动选取的建模光谱范围为 9 875.7 ～ 3 922.5 cm-1，见图 4 （3） ～ （6）。 采用主成分分析对普通水丸样品的近红外光谱数据降维。5个主成分的贡献率分别为 74.2%、 23.3%、 1.7%、0.6%和0.2%， 累积贡献率为 100.0%， 相应的得分见表4。

表4 普通水丸部分建模光谱的前5个主成分得分Tab.4 First five p rincipal com ponents scores of par tial modeling spectra for common watered pills

以前5个主成分的得分建立普通水丸的厂家判别分析模型，校正集和验证集的正判率均为100.0%。 留一法交叉验证的正判率为 100.0%，表明模型的稳定性良好。采用改变丸剂样品填装高度至约为 1.1 cm时测得的近红外漫反射光谱数据进行分析， 正判率为 100.0%， 表明模型的耐用性良好。 图 5 （2） 显示厂 C、 D、 E和 F的校正样品各自聚集，表明不同厂家普通水丸的总体质量存在显著差异。 图中大写字母 C、D、E和 F表示相应的厂家。

2.3.2 广义方差分析

上述结果表明，近红外光谱判别分析能够准确、直观地识别黄连上清丸的不同厂家；而近红外光谱广义方差分析能够量化表征黄连上清丸不同厂家间的差异大小。以上两个分析方法一起使用，能够同时定性、定量地表征黄连上清丸各厂家间的总体质量差异。与丸剂的制剂类型间总体质量差异分析相比，厂家判别分析模型使用的主成分数较多、广义方差值较小，均表明厂间总体质量差异较制剂类型间的小。

2.4 批间总体质量差异分析

2.4.1 主成分分析

2.4.1.1 浓缩水丸 分别计算黄连上清丸厂 A和厂 B共19批各批样品的平均近红外光谱。 软件自动选取的建模光谱范围为 9 875.7 ～3 922.5 cm-1。采用主成分分析对各批样品的平均近红外光谱数据降维， 前 3 个主成分 （ 贡献率分别为 85.1%、11.5%和 3.1%， 累积贡献率为 99.7%） 的得分在三维空间的分布见图 6 （1）。图 6 （1）显示， 厂A各批样品的平均近红外光谱数据的主成分得分明显比厂B的集中，说明厂A的批间总体质量差异比厂B的小。

图6 黄连上清丸各批样品平均近红外光谱数据前 3个主成分的得分在三维空间的分布Fig.6 Three-d imensional distributions of the first three principal components scores of themean NIR spectra for each batch of Huanglian Shangqing Pills

2.4.1.2 普通水丸 分别计算黄连上清丸厂 C、D、 E和F共12 批各批样品的平均近红外光谱。 前3 个 主 成 分 （贡 献 率 分 别 为 74.0%、23.5% 和1.7%， 累积贡献率 99.2%）的得分在三维空间的分布见图 6 （2）。 图 6 （2） 说明厂 C的批间总体质量差异比厂D、 E和F的小。

2.4.2 广义方差分析

上述结果表明，近红外光谱主成分分析能够直观表征黄连上清丸的批间总体质量差异；而近红外光谱广义方差分析能够量化表征黄连上清丸的批间差异大小，可用于厂内偏差警戒限及纠偏限的设定。以上两个分析方法一起使用，能够同时定性、定量地表征黄连上清丸批间的总体质量差异。此外，虽然厂E和厂F各自只有2批样品，不能参与普通水丸广义方差值的计算，但其批间总体质量差异仍然能够用主成分分析进行识别。比较广义方差值可知，黄连上清丸批间总体质量差异较其厂间及制剂类型间的小。

综上所述，黄连上清丸总体质量差异按制剂类型间、厂间和批间的顺序递减。所建近红外光谱法能够高通量无损分析黄连上清丸的总体质量差异。其中，制剂类型间及厂间的总体质量差异分析策略可用于监督管理与质量控制；批间的总体质量差异分析策略可用于厂内偏差警戒限及纠偏限的设定及过程控制［18］。

3 讨论

3.1 光谱测量参数 分辨率和扫描次数均是近红外光谱测量的重要参数。分别针对丸剂和丸粉样品， 考察 了 分 辨率 2 cm-1、 4 cm-1、8 cm-1和16 cm-1， 扫描次数 32、 64 和 128。 结果， 丸剂样品以分辨率 4 cm-1和扫描次数 64 为宜； 丸粉样品以分辨率 8 cm-1和扫描次数 64 为宜。

3.2 光谱处理方法 比较了未处理、 一阶导数、二阶导数、Savitzky-Golay平滑和 Norris平滑处理的光谱数据所建判别分析模型的性能。结果显示，未处理光谱数据所建判别分析模型的性能较好，且计算简单。故本实验采用原始光谱数据进行分析。

致谢：感谢重庆市科委应用技术研发项目（cstc2012gg-yyjs10039） 和重庆市渝中区科委科技计划项目 （20120206） 的资助；感谢赛默飞世尔科技有限公司的支持。

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H igh-throughput analysis of population quality of Huanglian Shangqing Pills by near infrared spectroscopy

CHEN Yang1， FAN Qi1*， WANG Yi-wu2， DONG Yan-hong1， WU Ruan-qi1， LI Juan1
（1.Schoolof Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China； 2.Pharmaceutical Experiment Centre， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

AIM To establish high-throughput， rapid and non-destructive approaches of near infrared spectro scopy to analyse the population quality variances of Huanglian Shangqing Pills.METHODS Concentrated and watered pills and common watered pills of Huanglian Shangqing Pills were obtained from six manufacturers and served as calibration set and validation set， respectively.Near infrared diffuse reflectance spectra combined with principle component analysis were used for discriminant analysis and the calculation of covariancematrix S for generalized variance analysis.RESULTS The accuracy of predictingmodel，calibration set and validation set were approximately to 100%.CONCLUSION Near infrared spectroscopy plus discriminantanalysis could distinguish themanufacturers and their preparations， and plus generalized variance would present the population quality of Huanglian Shangqing Pills.

near infrared spectroscopy； chemometrics； whole quality variance； Huanglian Shangqing Pills

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0973-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.020

2013-06-25

重庆市科委应用技术研发项目 （ cstc2012gg-yyjs10039） ； 重庆市渝中区科委科技计划项目 （20120206）

陈 杨 （1987—） ， 男， 硕士生， 从事药物分析研究。 Tel： 13452825101， E-mail： chenyang86109@gmail.com

*通信作者： 范 琦 （1961—） ， 女， 博士， 教授， 从事药物分析研究。 Tel： （023） 68485161， E-mail： fanqi787@gmail.com