无机介孔材料在第三代电化学生物传感器中的应用研究

张 玲，矫松林，张潆之，范 蕴，张洪波，段纪东

（沈阳师范大学 化学与生命科学学院，沈阳 110034）

0 引 言

在工农业生产、环境保护、临床检验以及食品工业等领域，为了监控产品质量，往往要求在很短的时间内完成样品检测，有的甚至要求在线或活体内直接检测。生物传感器作为直接或间接检测生物分子、生理或生化过程相关参数的分析器件，由于具有灵敏度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉、可以实现连续在位检测等特点，在生物医学、环境监测、食品医药工业等领域展现出十分广阔的应用前景［1］。

生物传感器（Biosensor）是以生物活性物质（如酶，抗体，核酸，细胞等）为生物敏感基元，通过信号转换器将生物化学信号转化为相应物理化学信号的装置。其中以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电势、电流或电容为特征检测信号的生物传感器称为电化学生物传感器（Electrochemical Biosensor），也称为生物电极［2］。

根据媒介体的不同，电化学生物传感器的发展可分为3个阶段：第一代、第二代和第三代生物传感器（部分1）。第一代生物传感器（葡萄糖生物传感器）是在1962年由Clark和Lyons首先发明的［3］。在这种生物传感器中，氧气作为媒介体来实现蛋白质和电极间电子转移。尽管第一代生物感应器仍在商业中扮演重要角色，它们也有很多缺点，如：过电势高，氧气的干扰，制作过程复杂等。以人工合成的电活性小分子为电子媒介体的电化学生物传感器称为第二代电化学生物传感器。具有检测电势低，受环境干扰小，可在复杂的有机、生化样品中进行快速分析检测等优点，明显克服了第一代的一些缺点。然而，电子媒介体促进氧化还原蛋白质电子转移的同时，还会发生各种各样的副反应以及存在污染检测液等问题［4］。在第三代生物传感器中，由于蛋白质的直接电子转移避免了电子媒介体的使用，从而为生物传感器提供了更好的选择性。首先，它们能够在氧化还原蛋白质本身的电势值附近工作，因此产生的副反应少；其次，一些蛋白质和酶是底物的专属催化剂，对底物具有更好的选择性和更高的亲和性。然而，在裸露电极表面，直接实现蛋白质的直接电子转移比较困难，这是由于氧化还原蛋白质的分子很大，氧化还原中心被多肽链包围，深埋在氧化还原蛋白中心，处于具有三维结构的裂隙中且不易暴露，且这些裂隙具有高度的疏水性，因此很难接近电极表面，阻碍了其与电极间的电子转移。实现氧化还原蛋白的直接电化学，要满足以下条件：一是缩短氧化还原蛋白的活性中心与电极间的距离；二是保持氧化还原蛋白的生物活性，能够催化底物［5］。

自从1977年Hill［6］和Kuwana［7］发表了使用电子促进剂4，4′－联吡啶促进Cyt C的电化学反应的报告后，近些年来关于第三代生物感应器的研究得到了广泛地发展。迄今为止，各种各样的新型电极材料和多种蛋白质已经被应用于第三代生物传感器的研究。鉴于能够实现直接电子转移的蛋白质种类有限，新型材料的发现和使用为第三代生物传感器的发展拓宽了道路。表面活性剂［8］，聚合物［9－10］，凝胶［11－12］以及无机材料［13－16］都被证明是蛋白质很好的固载材料并可以促进氧化还原蛋白质的直接电子转移。相对于有机材料来说，无机材料因具有规整的结构，可调节的孔结构，很好的机械稳定性及热稳定性等优良性质，而受到生物材料研究者的广泛关注。

无机介孔材料因其纳米孔道具有的小尺寸效应、表面与界面效应使其呈现出独特性能。而且，一般生物大分子如蛋白质、酶、核酸等，当它们的分子质量在1～100万时尺寸小于10nm，相对分子质量在1 000万左右的病毒其尺寸在30nm左右。有序无机介孔材料的孔径可在2～50nm连续调节和无生理毒性的特点使其非常适用于酶、蛋白质等的固定和分离。1996年Díaz和Balkus［17］发表了第一篇关于分子筛固载蛋白质的文章，自此无机介孔材料应用于固载蛋白质的研究有了飞速的发展。目前，使用无机介孔材料固载蛋白质已经在生物分离和催化领域得到了深入研究。一系列蛋白质和酶（例如血红蛋白、过氧化氢酶和蛋白水解酶）已被用于制备多种生物－介孔杂化材料［14，18－19］。研究表明，尽管被固定酶的活性通常低于溶液中的酶，但被固定在介孔基底上的酶与溶液中的酶相比，往往具有更高的稳定性。无机介孔材料在第三代电介孔材料的引入，为构建新型、高效的生物传感器体系提供了机会。

1 硅基介孔材料在第三代电化学生物传感器中的应用

自20世纪90年代早期发现介孔结构的硅基材料以来，多种不同的无机介孔材料均被发展用于固载蛋白质，除了介孔硅材料［17，20］，还有介孔金属氧化物［21］和介孔碳材料［22－23］。

介孔硅材料，尤其是有序介孔硅酸盐，在蛋白质固载领域的应用最为广泛。这是因为它们具有生物相容性，孔道规则有序，比表面积巨大等优点。固载于介孔硅材料上的酶由于介孔的纳米孔道的保护通常显示出良好的稳定性。

使用介孔硅固载蛋白质在生物分离，生物催化等方面发挥了巨大的优势。然而，2000年，Washmon－Kriel才首次将介孔硅材料应用于第三代生物传感器的研究［24］。Washmon－Kriel研究了细胞色素C（Cyt.C）在有序介孔分子筛 MCM－48（2～4nm）和SBA－15（5～30nm）上的固载。实验发现，在蛋白质易变性的溶液中，固载于分子筛中的蛋白质仍保持很好的生物活性和稳定性，在接下来的几个月的时间里，循环伏安结果表明固载后的Cyt.C仍保留着它的氧化还原活性。与石墨和Cyt.C混合压片的样品做对比，发现尽管固载于介孔硅上的Cyt.C表现出较弱的直接电子转移信号，但固定后的Cyt.C的稳定性是非常明显的。也许受前期制备的介孔二氧化硅的孔径较小等原因的影响，介孔硅在第三代生物传感器中的应用的研究非常有限。4年后，鞠熀先组才报道了使用六边形有序介孔硅材料（HMS）固载系列氧化还原蛋白质用于直接电化学的研究。在研究中使用的氧化还原蛋白质包括：血红蛋白（Hb）、肌蛋红白（Mb）和辣根过氧化酶（HRP）［18－19］。HMS根据合成时使用的表面活性剂的不同，孔径不同。其中，使用十八烷基胺（ODA）做表面活性剂得到的介孔HMS的孔径为4.04nm，使用十二烷基胺（DDA）做表面活性剂得到的介孔孔径为3.35nm。研究表明固载于HMS上的氧化还原蛋白质均表现出了直接电子转移性能。其中，在ODA－HMS上被固定的HRP比在DDA－HMS上表现出了更明显的电化学响应，研究者推断是这种更显著的电化学响应是因为ODA－HMS具有更大的孔径从而利于HRP吸附。在此基础上，固载于HMS上的氧化还原蛋白质还被应用于过氧化氢和亚硝酸盐的电化学催化研究。此外，固载于六边形有序介孔硅材料（MCM－41）的葡萄糖氧化酶也表现出很好的直接电化学响应［25］。随着纳米技术的发展，近年来，具有大尺寸孔径的介孔硅材料越来越受到人们的关注，因为大尺寸孔径增加了对不同尺寸蛋白质的选择性，为后续介孔材料的化学修饰提供了更大的可利用空间，为增加介孔材料的功能性提供了可能性［26－28］。朱俊杰组使用SBA－15（直径30nm）固载Hb获得了Hb的直接电子转移，并且实现了对过氧化氢的还原催化［29］。李景虹组选择了具有双孔径分布的介孔硅（BMS）作为固载Hb的基底，它具有10～40nm的较大孔径和2～3nm小孔孔径。固载的Hb表现出很好的直接电化学响应，并且与没有BMS时相比，显示了更好的电化学催化性能。研究者推断这种高效的电化学催化性能可能是由于BMS双孔径的分布结构，即大的孔道为蛋白质的固载提供了有效空间，而它的小孔则为物质的传输提供了便利［30］。

随着介孔材料在第三代生物传感器研究的深入，为了提高固载蛋白质的直接电化学信号，金、量子点（QDs）、铂纳米粒子作为促进剂也被尝试着应用于介孔硅固载蛋白质体系［31－34］。金利通研究组对比了介孔SBA－15固载Hb修饰电极和Au掺杂SBA－15（Au－SBA－15）固载Hb两体系的直接电化学行为，发现Hb在两体系中均具有直接电化学信号。然而，固载于Au－SBA－15中的Hb修饰电极表现出更高的电子转移速率。使用计时安培法对比研究Hb／SBA－15和Hb／Au－SBA－15对氢过氧化的催化活性，发现Hb／Au－SBA－15对过氧化氢的响应电流是Hb／SBA－15的响应电流的3倍，具有更宽的线性检测范围和和更小的Michaelis常数（Km）。李景虹组应用了量子点（DQs）来促进固载于介孔硅材料MCF中的Mb的电子转移，并且获得了与金利通组相似的实验结果［33］。Azadeh Azadbakht在最新发表的文章中使用双金属Au－Pt纳米纤维制备修饰电极，然后涂覆MCM－41固载Hb的nafion混合液，发现该电极对痕量过氧化氢具有良好响应［35］。

综上所述，无机介孔硅材料是一种有效的、可保持蛋白质活性的适宜载体。使用具有恰当孔径大小的的介孔硅并用恰当的方式实现蛋白质在介孔硅材料上的固载，可以使固载蛋白质表现出直接电化学信号。在诸如金、量子点等促进剂的辅助下，固载蛋白质的直接电化学性能可以被大大地提高。总而言之，介孔硅为蛋白质的直接电子转移和第三代生物传感器的构建提供了有效的平台［14］。

2 非硅基介孔材料在第三代电化学生物传感器中的应用

除了无机介孔硅基材料，许多科研工作者也发现了其他介孔材料在第三代生物传感器上的应用潜力，例如：介孔碳、介孔硅－碳及介孔金属氧化物。

介孔碳由于它的低成本和在导电方面出色的表现，在固载蛋白质方面受到研究者们的关注。冯九菊等研究者使用壳聚糖作为介孔碳（CMK－3，孔径3.2nm）和玻碳电极表面之间的连接剂，通过层层组装的方法制备了（Hb／CMK－3）n多层膜［36］。修饰层达到六层之前，随着层数的增加，Hb的氧化还原信号也在增加，这就意味着多层固载Hb参与了直接电子转移。当n＝6的时候，峰电流最大。层数继续增长后，电流逐渐趋于平稳。另外，（Hb／CMK－3）6电极对氧气具有良好的催化效果，其催化能力比固载于二氧化钛多层膜的Hb还要好［37］。孙威等人使用介孔碳作为葡萄糖氧化酶的载体并混合离子液体，制备新型碳糊电极。固载葡萄糖氧化酶表现出良好的直接电子转移信号，且对葡萄糖具有灵敏的响应和较低的米氏常数。该研究者同时也强调该方法具有一定的普适性，可以固载其他氧化还原蛋白质用于第三代生物传感器中的研究［38］。磁性介孔碳因其既具有介孔结构可以固载酶的优点同时也具有磁性的易分离特性，因此受到了研究者们的关注［39－40］。于晶晶首次利用磁性介孔碳固载葡萄糖氧化酶实现了酶的直接电化学［39］。

吴寿等报道了关于使用介孔二氧化硅－碳泡沫复合材料（MSCF）固载蛋白质用于第三代生物传感的研究［41］。MSCF具有4纳米的孔道，内部通过更细小的瓶颈通道相连接。使用交流阻抗技术进行表征发现MSCF拥有类似单壁碳纳米管和多壁碳纳米管的的良好导电性，这是由于碳参杂于硅介孔结构中所引起的。研究发现，MSCF结合了介孔碳的生物相容性和介孔二氧化硅材料的亲水性。固载于介孔硅－碳中的葡萄糖氧化酶中心FAD／FADH2（FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸）表现出良好的了直接电子转移信号，对葡萄糖的响应具有检测范围宽、稳定性强和选择性好等特点。在空气饱和的条件下，该电极对葡萄糖的检测范围为0.05～5.0mM，大于氧敏葡萄糖生物传感器的所能检测的极限2mM［42］。

除了介孔碳和介孔硅－碳，有些金属氧化物介孔材料也在制造第三代生物传感器方面吸引了人们的关注。目前能够固载并实现蛋白质直接电化学的介孔金属氧化物主要有：二氧化钛［43］，，，氧化铟锡［45］，ZnO［47］等。Frank Marken组分别将 Hb［37］和Cyt.C固载于二氧化钛自组装层状膜中获得了蛋白质的直接电子转移［48－49］。随着膜厚的增加，Cyt.C的直接电化学响应增强。固载于二氧化钛膜中的Hb也表现出同样的直接电化学信号，通过动力学分析，膜中的电子转移属于有限扩散模式。该研究表明，二氧化钛介孔空间为蛋白质提供了适宜环境，有利于蛋白质的直接电子转移，而且随着膜厚的增加，不仅仅是电极表面的蛋白质参与了直接电子转移。除此之外，实验证明，钨的介孔氧化物和介孔Nb2O5也都可以实现蛋白质的直接电子转移［5，13］。制备得到的 Hb／WO3和HRP／Nb2O5电极对和H2O2具有良好的检测性能。Yeni Astuti等人报道了伴随质子参与的黄素氧化还原蛋白（Fld）的光谱电化学研究，发现Fld能够在介孔二氧化锡电极发生直接电子转移［50］。Stefano Frasca等研究者使用透明的介孔化铟锡（ITO电极）固载Cyt.C，在光谱检测的同时进行了电化学检测并获得了Cyt.C在电极表面的直接电子转移，固载的Cyt.C能够催化，该研究结合了电极表面氧化物的介孔结构特征及材质透明的特点，展现了该类透明氧化物材料在催化体系研究的魅力，为构建其他过氧化物检测体系提供了一种新方法［45］。

3 结 语

无机介孔材料是固载蛋白质构建第三代电化学生物传感器的适宜材料。具有生物相容性好，蛋白质固载量高，孔径可调，机械性能高稳定性好等优点。随着材料合成技术的发展，多种新型介孔材料的出现丰富了固载蛋白质的种类，为深入研究介孔孔道结构、孔径与第三代生物传感器性能之间的关系提供了模型。使用无机介孔材料构建第三代电化学生物传感器为改善其敏感度、扩大其检测范围提供了美好前景。

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