低温秸秆降解微生物菌剂的研究进展

赵旭 王文丽 李娟 呼和

（甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所，兰州 730070）

低温秸秆降解微生物菌剂的研究进展

赵旭 王文丽 李娟 呼和

（甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所，兰州 730070）

秸秆的成分主要有纤维素、半纤维素和木质素等，降解秸秆的微生物包括细菌、放线菌和真菌。低温秸秆降解微生物的选育方法有直接从自然界中筛选、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种等。目前，筛选获得的低温秸秆降解菌株的数量有限，降解秸秆的能力不高，低温条件下菌株的降解机理都需要进一步的研究。综述了低温条件下秸秆降解微生物菌剂的研究进展。

低温降解 作物秸秆 微生物 秸秆还田

农作物秸秆是自然界中丰富的可再生资源［1］，截至2009年，我国农作物秸秆可收集资源量达到6.87×108t，理论资源量达到8.20×108t，约占世界秸秆总量的20%-30%。秸秆的类型主要有水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、杂粮秸秆、薯类秸秆、豆类秸秆、棉花秸秆、油菜秸秆和花生秸秆等，其中玉米秸秆占35%，小麦秸秆占21%，稻草占19%［2］，三大作物秸秆占秸秆总量的75%，其他作物秸秆占25%［3］。但由于作物秸秆不能在短时间内被腐解利用，大部分秸秆被直接焚烧，不仅造成资源的浪费，还污染了环境。近年来，为了充分利用秸秆，经过不断的研究开发，形成了秸秆还田作肥料；秸秆气化、热解发电；秸秆粉碎配比作食用菌基料；秸秆青贮、氨化、盐化作饲料；秸秆加工成型或做编织原料等5条利用途径［4］。随着农业技术的迅猛发展，秸秆还田越来越受到重视。作物秸秆原位还田，不仅可以提高秸秆的综合利用率，而且可以提高土壤肥力、培肥改土。然而我国北方秋冬季节气温低、冰期长、冻土层厚、气候干旱冷凉，秸秆进入土壤后，腐解缓慢，还田几个月后秸秆变化不大。由于不能及时腐解，大量秸秆还田后影响农田土壤整地和作物的播种，使一些病虫和病原菌在土壤中长时间存活，给作物生长带来严重的危害。如果还田秸秆的大部分在短时间内腐解，不仅不会影响作物的生根及成活，而且还能提高产量，推广的意义非常重大。为了提高秸秆降解效率，科学家们对秸秆降解微生物

菌剂进行了大量研究，并获得了多种降解秸秆纤维素、木质素的菌株，但目前研究获得的菌株都存在酶活低、稳定性差、易退化、特别是耐冷性弱等问题，并未显著提高还田效果，因而选育耐低温高效降解秸秆的菌株对进一步有效利用农作物秸秆具有非常重要的意义。本文系统阐述了国内外有关低温秸秆降解微生物的研究进展，并展望了今后的发展趋势。

1 秸秆的主要成分及自然降解过程

1.1 秸秆的主要成分

作物秸秆分茎和叶两部分，秸秆表面有一层非常致密的角质蜡状膜，这种膜由脂溶性的脂肪醇、脂肪酸、烷烃、酮类、醛类和酯类等有机分子组成［5］。秸秆表面光滑，蜡质层中含有的SiO2和低聚物能防止秸秆在生长过程中水分过度蒸发和病菌的侵入，但表面蜡质层也影响了微生物降解秸秆的速率。秸秆的干物质一般由灰分和含氮化合物与非含氮化合物组成。含氮化合物包括蛋白质和其他含氮物；非含氮化合物包括纤维素、半纤维素和木质素等。其中非含氮化合物约占秸秆干重80%。水稻、小麦及玉米等农作物秸秆的纤维素含量约为30%-35%，半纤维素含量约为25%-30%，木质素含量约为20%-25%［6］。秸秆的碳氮比很高，而微生物生长对C/N值的要求在30左右，所以秸秆在自然腐解过程中将与作物争夺无机氮，腐解效率低，影响作物的生长。纤维素类物质是植物细胞壁的主要成分，它包括纤维素、半纤维素和三维网状结构的木质素等［7］。纤维素是葡萄糖以β-1，4糖苷键结合形成的直链高分子化合物，分子式为：（C6H10O5）n，含碳 44.44%、氢6.17%、氧49.39%［8］。纤维素分子主要由结晶区（Crystalline）和非结晶区（Amorphism）两部分组成，结晶度一般在30%-80%之间，结晶区分子链内、链间及分子链与表面分子之间形成的氢键，使纤维素分子结构稳定难以被降解，非结晶区纤维素结构比较疏松，容易被微生物降解利用［9，10］。常温条件下，纤维素既不溶于乙醇和乙醚等有机溶剂，也不溶于稀碱溶液。Petersson 等［11］研究发现纤维素分子间以及分子内存在大量的氢键，这给纤维素水解带来很大的困难。虽然稀酸不能水解纤维素，但稀酸或纤维素酶等可渗入纤维结晶区使纤维素生成D-葡萄糖、寡糖和纤维二糖。

1.2 秸秆的自然降解过程

作物秸秆的纤维素、半纤维素以及木质素的降解机理各不相同，因而其降解微生物也存在差异。纤维素的降解是通过内切型葡聚糖酶（Cx酶）、外切型葡聚糖酶（C1酶）和β-葡萄糖苷酶（Cb酶）等协同作用实现的［12］。纤维素是通过酶的纤维素结合结构域与酶分子连接的，然后利用催化结构水解纤维素。研究者一般只研究其中部分酶的活性，没有全面了解菌株的降解酶系，存在酶组分比例不协调等问题［13］。降解纤维素的菌株主要有芽孢杆菌类细菌、放线菌以及木霉等。尹礎等［14］以纤维素为唯一碳源筛选获得一株具有秸秆降解功能的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），并研究了其产酶能力。木质素的降解机制非常复杂，主要有3种酶系组成：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。参与降解木质素的微生物有细菌、真菌及相关微生物菌群，降解的菌株主要有白腐真菌［15］。秸秆的自然降解需要多种酶系在适宜的条件下协同作用，单菌株由于不能分泌健全的降解酶系，很难达到对秸秆的完全降解［12］。宋亚彬等［16］研究了木质纤维素降解复合菌系的培养条件，确定了最佳培养碳源、氮源、pH、温度等。史玉英等［17］研究发现纤维素分解菌与木质素分解菌对稻草的联合分解能力明显高于单一菌株，所以秸秆降解菌剂的研究逐渐由单菌种的筛选转变为菌群的筛选。

2 秸秆降解微生物的种类

微生物的生命特征多种多样，生活方式丰富多彩，与自然界中的其他生物相互作用，适应不同的生态环境，代谢方式和生理功能千差万别。利用秸秆降解微生物菌剂处理秸杆，在适宜的温度和湿度条件下将秸秆中的有机物质矿化、腐殖化，使秸杆中的有机物、微量元素以及速效N、P、K回归到土壤中，提高土壤肥力，改善土壤结构，增加作物产量。秸秆降解不同阶段发挥主要作用的微生物各不相同，第一阶段主要是细菌利用秸秆中的可溶性物质生长繁殖，腐殖质开始积累；第二阶段主要是真菌降解木质素，此阶段大量积累腐殖质；第三阶段主要是放线菌分解腐殖质的过程。

细菌和真菌主要参加木质素的降解，首先是真菌对木质素进行矿化，然后细菌利用其体积小、营养物质吸收面大、物质交换快等特点，切断木质素的分子链，改变木质素的性质，使其变为易降解的低分子量聚合木质素片段［18］。降解秸秆的细菌有地衣芽孢杆菌、假单胞杆菌、亮丝杆菌、产碱杆菌、枯草芽孢杆菌等。有学者利用稀释平板法筛选出一株耐热并高效降解秸秆的细菌，经鉴定为地衣芽孢杆菌［19］；贺芸［20］利用分离筛选方法得到一株产胞外耐高温纤维素酶的细菌，鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌。陈丽燕等［21］从腐烂枯枝落叶土壤中分离筛选得到2株产纤维素酶的菌株，分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），液体摇瓶培养4 d后，CMC酶活分别可达163.3 U/mL 和167.17 U/mL。吕明生等［22］从海水和海泥样品中分离筛选出一株产纤维素酶的菌株，经鉴定为交替假单孢菌属（Pseudoalteromonas sp.），该菌株为革兰氏阴性杆状细菌，有荚膜，无芽孢，生长温度范围为4-35℃，最适生长温度为25℃；最适生长pH为8.0；最适生长NaCl浓度为3%。

放线菌生长繁殖速度缓慢，但其生长的酸碱范围和温差范围很宽，并可以在恶劣环境下形成芽孢，适应周围环境的能力极强，是一类降解秸秆能力较强的微生物。研究表明降解秸杆的放线菌主要有链霉菌属（Streptomyces）、黑红旋丝放线菌（Actinomyces melaocyclus）、玫瑰色放线菌（Actinomyces roseodiastaticus）、纤维放线菌（Actinomyces cellulosae）、小单胞菌（Micromonospora）等，其降解机制主要是放线菌可以比较容易的穿透秸秆纤维等不溶基质，在中、碱性环境中增加秸秆的水溶性，促进秸秆快速降解。宋波等［23］从草食性动物的粪便中筛选得到1株能降解纤维素的菌株，经过鉴定为链霉菌属。周新萍等［24］从朽木中分离得到一株产纤维素酶活力较高的放线菌NC-7，鉴定为生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）。

真菌能分泌胞外酶，且菌丝对难降解的木质素醋质层具有机械穿插作用。因此，真菌对纤维素、半纤维素和木质素有很强的分解作用，是降解秸秆效率最好的微生物菌群，同时也是目前研究最多的降解秸秆的微生物。20世纪中叶以来，科学家们获得了大量降解秸秆的真菌，尤以木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、漆斑霉属（Myrothecium）、毛壳霉属（Chaetomium）、曲霉属（Aspergillus）等为主［25-29］。有学者利用稀释涂布平板的方法从土壤中分离筛选出 4株降解秸秆能力较强的真菌，鉴定为肉座菌属的黄曲霉、草酸青霉、木霉和烟曲霉［30］。魏亚琴等［31］从位于兰州市榆中县的兴隆山国家自然保护区采集的腐土中分离筛选出一株CMC酶活高达1 376.2 IU/mL，FPA酶活高达497.78 IU/mL的菌株，初步鉴定该菌株属于青霉属。协助降解秸秆的酵母菌主要有啤酒酵母、粗球孢子菌和酿酒酵母等。降解秸秆的霉菌主要有青霉、曲霉、木霉、毛壳菌和白腐菌等［32-35］。张明珠等［36］从腐木和土壤中筛选出一株绿色木霉，其CX 酶活达23.49 U/mL。该菌可使秸秆的纤维素含量降低14%、木质素含量降低2.8%。有学者［37］采用康氏木霉和黑曲霉与乳酸菌共同厌氧发酵秸秆，结果显示，菌群能有效降解秸秆的细胞壁。

3 低温秸秆降解微生物的选育方法

低温环境是地球表面最丰富的环境，约占70%。在低温环境中存在着很多生物体，特别是细菌、真菌等微生物。根据低温微生物生长温度的不同将其划分为嗜冷菌（Psychrophiles）和耐冷菌（Psychrotrophys）。嗜冷菌的最高生长温度为20℃，而耐冷菌能在0℃条件下生长，但生长的上限温度必须低于40℃。低温微生物适应环境的能力主要得益于其体内的生化反应能在低温下高效进行。适应低温的能力包括生物体能够在低温下生产和保存适当的新陈代谢产物，并且参与代谢的酶在低温下具有高效的催化活性。低温环境下水的黏度会明显增大，热运动会显著降低，酶分子要在这样的环境下保持有效的催化效率，必须使结构更加柔韧。已报道的低温秸秆降解菌既有嗜冷菌又有耐冷菌，一般最适生长温度在10-25℃，多数不能在超过37℃的条件下生长［38］。随着科学研究的不断深入，学者们在低温秸秆降解微生物选育方面也积累了丰富的经验。最早，科学家是直接从自然界中人工筛选优良的菌种，但是由于自然选育不能满足人们的生产需要，人们开始运用新兴的育种方法如诱变育种、原

生质体融合育种、基因工程育种等选育菌株。

3.1 从自然界中筛选育种

由于微生物具有适应强、易变异的特点，所以在自然界中存在许多具有特殊功能的菌株。早期应用在酒精、乳酸、丙酮、丁醇生产中的优良菌种，主要是从自然界中筛选获得的。自然筛选仍然是目前获得降解秸秆高效菌种的方法之一，如萨如拉等［39］从腐烂的树叶和高原锯末中筛选到两组玉米秸秆降解复合菌系1号和8号。1号和8号复合菌系在玉米秸秆培养基中，15℃培养15 d，玉米秸秆分解率分别达到30.21%和32.21%。张恒芳等［40］在低温条件下通过初筛、复筛，从腐烂的玉米秸秆垛土壤中分离出2株在低温条件下降解玉米秸秆能力较强的菌株，处理玉米秸秆10 d，降解率分别达30.80%和31.52%。直接从自然界中筛选菌株也存在缺点，如自然界中菌株的突变率低，对目标性状的正突变少，缺乏定向诱变的能力，工作量大，筛选效率低下等，需要新兴的育种方法提高选育菌株的效率，为进一步开发利用微生物资源提供技术支撑。

3.2 原生质体融合育种

原生质体融合是指利用物理、化学或生物的手段将两种不同亲株的脱壁细菌细胞或植物细胞的原生质体合并到一起，使细胞内的遗传物质发生重组交换，获得兼有双亲性状的稳定重组子的过程。原生质体融合育种的优势在于其可以提高变异的频率，缩短育种时间。目前，采用原生质体融合技术选育稳定高产纤维素酶菌株的研究越来越多。张新峰等［41］采用紫外线对嗜热真菌原生质体进行诱变处理，成功选育出3株遗传性能稳定的木聚糖酶高产诱变株，木聚糖酶的酶活分别提高了26.5%、37.78%和28.2%。胡婷婷等［42］利用紫外线诱变绿色木霉的原生质体，通过刚果红透明圈法筛选得到一株高产纤维素酶的菌株，其CMC酶活力比绿色木霉原菌提高了124.3%。黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活力很高，而里氏木霉外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶活力很高，这样就可以考虑利用原生质体融合技术把黑曲霉和里氏木霉这两个菌株的原生质体进行融合，使两个菌株实现优势性状互补［43，44］。原生质体融合技术操作复杂，产生的杂交后代同样没有定向性，而且必须有非常简便的筛选手段相配合才行。

3.3 物理化学诱变育种

物理化学技术是一种方便快捷的诱变选育优良微生物菌种的方法。这种方法可以使菌株的遗传性状发生很大的改变，提高菌株的突变频率，缩短获得目的性状菌株的程序和时间。常用的化学诱变剂有亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯等；常用的物理诱变剂有紫外线、60Co-Y射线等。管斌等［45］利用紫外线、亚硝基胍等对里氏木霉进行低剂量、反复多次复合诱变处理，以2-脱氧葡萄糖代替葡萄糖作为阻遏物的结构类似物，筛选出一株纤维素酶活力比初始菌株高3倍的菌株。张苓花等［46］对康氏木霉W-925、J-931用浓度为2%硫酸二乙酯和紫外线复合诱变后，得到了一株诱变菌株，其CMC酶活性提高了100%，滤纸糖酶活性提高了81%。刘羽［47］利用紫外灯诱变从南极样品中分离筛选到能产生低温高效纤维素酶的菌株 QP7，得到一株具有比较稳定的遗传性的突变菌株QP7-1，它的酶活比出发菌株提高了24%。还有学者利用紫外线诱变拟康氏木霉，用具有葡萄糖浓度梯度的双层平板筛选，获得1株可以抗产物10%葡萄糖的突变株，该菌株制成干曲后其CMC酶活达1 145.7 IU/mL；滤纸酶活达到55.6 IU/mL［48］。陈光等［49］利用快中子对绿色木霉进行福照诱变，研究了不同剂量快中子对绿色木霉孢子遗传稳定性和致死率的影响。结果显示：福照剂量在1.2-4.8 Gy范围内绿色木霉的致死率随福照剂量的增加而上升，福照剂量为1.2 Gy时，绿色木霉的致死率达80%。筛选获得的突变株的CMC酶活达914.4 IU/mL，比出发菌株高30倍，FPA酶活为633.63 IU/mL，比出发菌株高4倍。物理化学诱变育种方法对菌株的致死率较高，并且诱变剂会污染环境，突变没有方向性，筛选鉴定的工作量较大，同样需要快捷高效的筛选方法配合。

3.4 基因工程育种

随着生物技术的迅猛发展，学者们开始利用基因工程手段克隆纤维素酶基因，并将其克隆至多种细菌和真菌，获得了高产纤维素酶的工程菌株。Wang等［50］利用致错突变株技术、易错PCR改造里氏木霉的内切葡聚糖酶基因eg3，获得一个

突变体321T，与出发菌株相比，其酶的最适pH升高了0.6个单位。Kim等［51］利用DNA改组技术改造来自枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因，获得了一株CMC酶活力比出发菌株高2.2倍的工程菌。游银伟等［52］从黄海海底淤泥中筛选出一株产纤维素酶的适冷革兰氏阴性杆菌MB1，克隆和分析了MB1 的16S rDNA 序列，经鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）。克隆该菌适冷内切葡聚糖酶基因celA，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 中进行了表达。重组E. coli 菌体破碎后，获取上清液，其中融合蛋白GST-CelA 浓度约为78.5 mg/L，分析融合酶GST-CelA 的性质，为中性适冷酶。熊鹏钧［53］从深海沉积物样品中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3，研究表明DY3在8℃环境中分泌的胞外酶能水解羧甲基纤维素。设计PCR引物从DY3总DNA中扩增出一个约1.5 kb的片段并将该片段克隆到T载体上进行测序。分析表明该片段长为1 479 bp，是一个属于糖基水解酶家族5的纤维素酶基因，命名为celX，利用pET-GST载体，celX基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中获得融合表达。表达纯化的产物能降解CMC产生纤维二糖和纤维三糖，分解纤维五糖产生纤维二糖和纤维三糖，分解纤维四糖产生纤维二糖。乔宇等［54］利用巴斯德毕赤酵母表达系统导入里氏木霉eg2基因，获得一株能够高效表达内切葡聚糖酶II的工程菌株Gp2025。利用甲醇诱导表达后，内切酶活力达到1 573.0 IU/mL。

4 低温秸秆降解微生物菌剂的应用

秸秆腐熟菌剂是通过现代生物及化学技术生产的微生物活体菌剂，能够促进农作物秸秆以及其他有机物料的腐熟［55］。早期研发秸秆腐熟剂时，研究人员主要利用纯菌降解秸秆，直到发现降解效果不理想后才开始进行多种菌株组合降解秸秆的研究。随着研究的不断深入，通过菌株淘汰和优化组合技术以及多种微生物之间的协同关系，人工筛选多个菌源，并构建产高效纤维素酶的复合腐熟菌剂，成为了腐熟菌剂研究的热点［56］。为了达到腐熟菌剂作用秸秆后不仅不影响下季作物的播种及生长，还可以增加农作物的产量，人们在腐熟菌剂的腐解稳定性、腐解效果以及安全性等方面进行了大量的研究，以便实现秸秆的直接还田、解决秸杆再生利用的问题［57］。秸秆腐熟菌剂的研究中，以嗜热的秸秆纤维素、木质素分解菌为主，而常温特别是低温发酵分解秸秆纤维素、木质素的菌株或菌群的研究较少，远远不能满足实际生产的需要。赵明文等［58］研究发现，接种分解菌群的秸秆废弃物发酵34 d后，与不接种的相比，秸秆分解率提高了13.6倍。在接种分解菌群的后75 d，作物的分叶数增加37.5%、单株干重增加19.77%、次生根增加11.87%；成熟时，有效穗增加了4.22%、每穗实粒数增加了1.72%、干粒重增加了2.08%、实际产量增加了8.42%。还有学者［59］研究对比了5种秸秆腐熟菌剂对稻秆的腐熟程度及对晚稻生长发育的影响。结果显示，5种腐熟剂都能使土壤中的有机质和各类营养成分显著提高，对晚稻的增产效果也很显著，但是5种腐熟菌剂处理间的差异不显著。丁波等［60］的研究表明，在田间铺盖的秸秆上喷洒秸秆腐熟剂后，小麦的增产高达101.6%-109.9%。秸秆在腐熟时需严格控制水分，菌剂的均匀程度及对秸秆的密封等都将影响腐熟的效果。秸秆堆沤还田主要采用厌氧发酵，这种方法虽然成本低廉，但存在堆沤时间长、受环境影响大的缺点，需要进一步研究获得能在低温条件下快速腐解秸秆，并促进农作物增产的微生物菌剂。

5 展望

秸秆还田不仅可以培肥地力、改善土壤理化性质，还能促进土壤中有益微生物种群的生长繁殖，能有效抑制各种病菌的生长，减少病害的发生。秸秆降解的关键是微生物技术的利用，而获得优良的菌株是微生物技术的核心。我国北方地区农作物秸秆数量巨大，但由于秋冬季节温度过低，秸秆还田后不易腐解，影响来年作物的播种及生长。在北方地区的温度条件下，分离筛选高效降解作物秸秆的菌株，并制备成复合菌剂，为解决我国北方地区作物秸秆的原位还田提供有力的技术支持，促进北方地区作物秸秆的合理开发利用，对解决我国粮食和资源短缺以及环境污染都有重大的现实意义。目前，虽然对低温秸秆腐解微生物进行了研究，但筛选获得的低温秸秆降解菌株数量有限，降解秸秆的能力

不高，并且低温条件下降解秸秆主要有哪几类微生物，秸秆降解不同阶段的优势种群有哪些，分解秸秆的酶在低温条件下是怎样发挥作用的，以及低温条件下菌落的演替规律等都需要进一步的研究。

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（责任编辑 狄艳红）

Advanced in Microbiological Agent of Straw Degradation Under Low Temperature

Zhao Xu Wang Wenli Li Juan Hu He
（Institute of Soil，Fertilizer and Water-saving Agriculture，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070）

The components of straw are cellulose, hemicellulose and lignin. Straw degradation microorganisms including bacteria, actinomyces and fungi. The methods of breeding straw degradation microorganisms include screening from nature, mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene engineering breeding and so on. At present, the straw degradation strains under low temperature can be screened few in number, the ability of straw degradation is confined, further study need to be done on the mechanism of low temperature straw degradation. Microbiological agent of straw degradation under low temperature was summarized.

Degradation under low temperature Crop straw Microorganisms Straw return to field

2014-04-14

甘肃省农业科学院农业科技创新专项（2012GAAS15-1）

赵旭，男，硕士，助理研究员，研究方向：农业微生物，环境微生物工程；E-mail：zhaoxv6939438@163.com