铁皮石斛种质资源研究进展

刘 莉，张 庭，潘 俊，李智敏，查应洪，张金渝*

(1.云南省农业科学院，药用植物研究所，云南 昆明650223;2.云南群鑫石斛种植有限公司，云南 屏边661200)

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)系兰科石斛属植物，国家二级保护植物［1］，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，有味甘、质重、黏性大等特点。铁皮石斛在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，被誉为“中华九大仙草”之首，具有“养阴生津，润喉护嗓，温胃明目，补肾益力，延年益寿”的功效［2］。现代的化学成分和药理研究表明铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和有效减轻肝损伤等作用［3－5］。铁皮石斛是药典记录加工枫斗的惟一来源［6］，铁皮枫斗是石斛类药材中一个较为著名的商品，常被视为价格昂贵的极品［7］。

铁皮石斛近年来价格呈逐年上涨趋势，当前市场鲜品价格为1500元/kg左右，而铁皮石斛软脚最高达到5 000元/kg。特别是云南广南软脚铁皮石斛更是特殊，目前用石斛的茎加工而成的铁皮枫斗国内市场价格超过50 000元/kg，日本、香港、泰国、新加坡等国的市场价格更高达8 000～10 000美元/kg，在我国华东、华南的一些大城市，特别在香港、台湾以及日本、东南亚一带普遍认为石斛是一种高档保健饮品。

铁皮石斛根据《中国植物志》(1999)，铁皮石斛属兰科石斛属植物［1］。中国产石斛根据Rshclechter(1919)的属下等级可分为12个组，铁皮石斛属石斛组Sect.Dnedrobimu。铁皮石斛主要分布在东亚、东南亚、澳大利亚等地区。中国的铁皮石斛主要分布在浙江、广西、云南、贵州等省区［6－8］，尤以云南省分布面积最广据不完全统计云南有7个地州市涉及瑞丽、潞西、盈江、陇川、梁河、腾冲、龙陵、镇康、沧源、耿马、云县、思茅、勐海、景洪、勐腊、绿春、金平、屏边、泸西、文山、广南等21个县(市、区)，有野生铁皮石斛分布。云南省种植铁皮石斛的企业和农户近100家，分布于全省的铁皮石斛居群主要包括云南省几家大型组培苗公司自主选育的铁皮石斛品种和由浙江、广东、广西等地采购的优质铁皮石斛种苗，居群数量不下30个。

1 铁皮石斛形态结构的差异

近几年来，一些学者对铁皮石斛的形态结构开展了一些研究工作。丁小余等对产于广西、贵州、云南三省区的铁皮石斛某些居群形态结构进行了比较分析，通常认为根据铁皮石斛的加工品质，可以分为便于加工的软脚铁皮(F型)和不便于加工的硬脚铁皮(H型)两种变异类型［9］。二者的形态结构具有明显差异。F型总体茎圆、柔软，茎表皮具较丰富的蜡质，适合做枫斗;H型铁皮石斛则具有茎较长，质地较硬等特征。F型铁皮石斛的茎不具有下皮层，横切面上维管束密度小，维管束内外侧纤维群不发达，基本组织中含有丰富的多糖粘性成分，茎短且柔软，具有粘性，是加工铁皮枫斗的优质材料;而H型的茎较长，具有发达厚壁的下皮层，横切面上维管束数目多、维管束鞘纤维发达，基本组织中的多糖成分少，因而茎杆较硬，粘性差，不适于铁皮枫斗的加工。Ding通过9年的时间对中国铁皮石斛居群进行了调查，根据产地的不同划分为8个居群，并认为GSC(韶山.广东)和FSC(顺昌.福建)两个种群是制作铁皮枫斗最佳的材料来源，且在高温高湿的环境下有很好的抗病性［10］。

2 铁皮石斛不同居群的化学成分研究

不同居群的铁皮石斛其化学成分含量不尽相同，据报道，种质显著影响铁皮石斛的甘露糖［11］，多糖和生物碱质量分数［12］。人工栽培铁皮石斛其有效成分含量的差异主要来自遗传差异，因此认为品种选育是提高铁皮石斛有效成分含量的有效途径。另外，应用指纹图谱技术对不同产地铁皮石斛药材在主要化学成分含量上的差异进行聚类分析可将云南铁皮石斛产地分为两大类，勐海与文山为一类，思茅、德宏、红河和玉溪为一类［13］。指纹图谱技术虽存在一些不足(如指纹图谱标准和评价体系不完善，仅对部分化学成分定性而未量化，化学信息与药理作用研究脱节等)，但在石斛种质资源鉴定和质量控制方面得到了广泛应用，并在不断发展和完善［14－15］。

铁皮石斛研究还应强化依据指纹图谱技术建立主要石斛类药材的质量标准，深入研究有效成分的药理作用。DAD－ELSD［16］联用可对指纹图谱的信息进行相互补充、完善，得到更广泛的信息量。但对强挥发性而未有很好紫外吸收的物质，是DAD－ELSD联用技术的一个盲区，需串联MS等检测器进行补充和完善。样品共有峰和相似度对评价中药材质量的共性有重要价值，但不同品种指纹图谱相互间的差异也有重要意义，可采用统计软件进行聚类分析、多重方差分析及主成分分析等，为石斛的系统研究提供可靠的数学依据。另外，HPLC以及HPLC/UV/MS指纹图谱技术已成为一种石斛种质鉴定和全面质量控制的有效手段之一。DNA指纹图谱简单便捷，它侧重于对石斛种源的鉴定，对辨别石斛不同的种或品种以及石斛药材真伪等方面十分有效。化学指纹图谱则侧重于对石斛品质的鉴定，它作为石斛自身的化学条码，所反映的化学成分信息既有种内的共性，又因产地不同而具有道地性，这为区分石斛药材的真伪与优劣，实行石斛药材质量控制提供了强而有力的技术支持［17］。

3 铁皮石斛不同居群的分子生物学研究

近年来，随着分子生物技术的不断发展，将分子生物技术手段应用于铁皮石斛遗传多样性研究也是一个热点。在铁皮石斛遗传多样性应用较多的技术主要包括:AFLP、RAPD、ISSR和SCoT技术。通过研究发现铁皮石斛遗传多样性丰富，遗传差异大，有利于开展优良种源的选择。Li用AFLP的方法结合POPGENE软件分析出铁皮石斛遗传多样性(HE=0.269);用AMOVA软件分析时显示，种群的相互之间遗传差异有轻微的变化，(ΦST系数=0.047～0.578)［18］。

RAPD技术分析铁皮石斛的遗传多样性研究显示各居群的多态性位点比率为91.35%［19］，说明铁皮石斛具有较为丰富的遗传多样性。铁皮石斛种质的亲缘关系远近与其地理种源具有显著的相关性，与栽培地点无关［11］。

近年来，ISSR已成功用于植物遗传多样性分析、DNA指纹图谱绘制、分子生态学研究等领域［20－26］。该技术无需预知受试基因组序列，成本低，操作简单且稳定性好，被认为是非常理想的研究居群问题的分子标记。卢家仕、沈洁等建立了铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系，并用于遗传多态性分析［27－28］。ISSR技术可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。卢家仕采用ISSR分子标记技术和非加权平均距离法对24份不同产地石斛属样品的遗传多样性和亲缘关系进行分析出其多态性为100%［29］。汪尚结合形态学性状，釆用SSR技术分析出其平均多态性比率为86.5%［30］。

目标起始密码子多态性分子标记(SCoT)技术应用于铁皮石斛的遗传多样性研究，发现不同来源的铁皮石斛人工栽培种存在较大的遗传差异，遗传多样性丰富，多态率达到90.3%［31］。SCoT和SSR标记相结合能够更明确了不同来源的铁皮石斛种质资源的亲缘关系和地理纬度关系密切，更进一步证明了SCoT和SSR标记对铁皮石斛遗传多样性、亲缘关系分析的可靠性［32］。

利用分子生物技术的手段，发掘重要性状的相关基因或紧密连锁的遗传标记，进行分子育种。

(1)随着基因组分析技术与生物信息学的发展，通过高效、廉价的基因组测序与GWAS技术，结合核心种质库的选择与多亲本群体或育种高世代群体的利用，可以有效地进行复杂性状相关的基因组区域与关联SNP的标记。为调控复杂性状的功能“模块”解析在全基因组水平上提供候选基因［33］。基于高通量基因组测序的基因型鉴定方法比目前广泛应用的分子标记分辨率提高35倍;成功开展了水稻重要农艺性状的基因组关联分析(GWAS)［34］;利用RNA－Seq技术成功分析了水稻全基因组的转录组;克隆了相应的全长cDNA并构建数据库。与水稻高产、优质、抗性和营养等重要农艺性状基因得到分离克隆［35－37］。

铁皮石斛基因克隆涉及关于蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)［38］和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)［39］的基因克隆;NAC转录因子、铁皮石斛细胞周期蛋白依赖激酶基因［40］促分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)［41］介导的级联途径和钙依赖蛋白激酶(calcium－dependent protein kinase，CDPK)在植物－根瘤/从枝菌根共生系统中发挥重要作用［42］等方面的研究。

4 铁皮石斛开发利用中存在的问题及展望

铁皮石斛是云南省高经济价值的药用植物，其粗加工品“枫斗”曾是我省出口创汇的医药品种之一。云南省铁皮石斛资源十分丰富，广泛分布于红河、文山、保山、德宏、普洱、西双版纳等州市。现有过百家企业建立了石斛种植基地，种植面积超过1万亩。由于铁皮石斛蕴涵极高的经济价值，且长期忽视培育与保护，过度采集利用导致野生资源濒临稀缺的状况。随着人工驯化栽培技术的日趋成熟，铁皮石斛的人工种植面积逐年增大，发展势头强劲。

铁皮石斛开发利用的主要问题:一是，某些产地分布的铁皮石斛因过度采挖种质资源逐渐消失，种群丧失，极不利于资源保护，应该加强野生石斛资源的系统收集、评价与利用;二是，缺乏经科学鉴定的优良品种。种植铁皮石斛的企业和农户盲目引种或采集野生资源作种源，对其生物学特性、有效成分的含量、区域适应性等缺乏了解，导致种植失败或造成重大经济损失。因此开展铁皮石斛多样性研究和优异种质的发掘十分必要。通过优异种质的发掘，从众多居群中发掘出有效成分含量高、丰产性好、适应性强的优异种质，为进一步开展铁皮石斛优良品种选育奠定前期工作基础;三是，铁皮石斛深加工产品品种单一，竞争力低而且无品牌效应，质量难保障，因此应该深入基础研究，加强功能与功效的宣传加强深度开发和利用，摆脱产品单一的局面。与此同时，加强政府的引导，防止产业盲目扩大［43－44］。

现代分子标记技术主要用于铁皮石斛的分子鉴定和遗传多样性的研究。铁皮石斛在分子育种方面的研究尚属空白。分子标记辅助育种需要继续加强分子标记研究，开发更多与优良农艺性状基因紧密连锁的分子标记，为通过遗传操作培育出高产优质的铁皮石斛新种质创造基础。铁皮石斛功能基因的研究仅包括cDNA文库构建和基因克隆分析两个方面，目前尚缺乏系统的基因组和转录组研究。功能基因的相关报道也仅限于克隆和表达模式分析，转基因功能验证方面的工作开展较少。因此，利用新一代高通量测序技术结合生物信息学解析铁皮石斛基因组和转录组信息，大规模发掘基因资源，以全面揭示铁皮石斛生长发育、代谢调控、菌根互作的分子基础［45］。分子生物学、动植物生物化学及遗传学的协同发展，推动了动植物功能基因组研究的快速进步，使大规模分离和鉴定调控基因及其作用网络，系统分析性状建成和调控机理成为可能，为“模块”的解析和组装提供了理论和技术保障;现代农学学科及农业生物育种学科的发展，越来越依赖合成生物学与系统生物学的理念，最终将实现农艺性状在全基因组水平上的优化与选择，达到复杂性状得以改良的新品种培育目标。以备利用基因工程手段为铁皮石斛的育种和产业化发展服务。

［1］吉占和.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1999，19:5－146.

［2］包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛［M］.上海:复旦大学出版社，2001:13－28.

［3］杨一令，来平凡，蒋士鹏.铁皮石斛研究进展［J］.山东中医药大学学报，2008，32(1):82－85.

［4］杨 虹，王顺春，王峥涛，等.铁皮石斛多糖的研究［J］.中国药学杂志，2004，39(4):257－257.

［5］刘 莉，萧凤回.石斛属药用植物多糖研究进展［J］.现代中药研究与实践，2009，23(1):77－80.

［6］高等植物图鉴编组.高等植物图鉴:第4册［M］.北京:科学出版社，1973.

［7］张治国.名贵中药－铁皮石斛［M］.上海:上海科学技术文献出版社，2006.

［8］包雪声.中国药用石斛［M］.上海:复旦大学出版社，2001.

［9］丁小余，徐珞珊，王峥涛.铁皮石斛居群差异的研究(H)植物体形态结构差异［J］.中草药，2001，32(9):828－831.

［10］GE D，GUO HX，W C Z，et al.Preliminary geoherbalism study of Dendrobium officinale food by DNA molecular markers［J］.Eur Food Res Technol，2007，10:812－813.

［11］苑 鹤，林二培，朱 波，等.铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性研究［J］.中草药，2011，3:566－569.

［12］诸 燕，张爱莲，何伯伟.铁皮石斛总生物碱含量变化规律［J］.中国中药杂志，2010，18:2 388－2 391.

［13］刘文杰，孙志蓉，杜 远，等.不同产地铁皮石斛主要化学成分及指纹图谱研究［J］.北京中医药大学学报，2013，36(2):117－120.

［14］NG T B，LIU JY，WONG J H，et al.Review of research on Dendrobium，a prized folk medicine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93:1 795－1 803.

［15］HOSSAIN M M.Therapeutic orchids:traditional uses and recent advances－An overview［J］.Fitoterapia，2011，82:102－140.

［16］石媛慧，郭 力，许 莉，等.不同品种石斛的HPLC－DAD－ELSD指纹图谱研究.世界科学技术—中医药现代化［J］.2013，15(6):1 329－1 332.

［17］李 杰，章金辉，朱根发，等.石斛属植物种质资源鉴定及指纹图谱应用研究进展［J］.中国农学通报，2013，29(16):63－68.

［18］LI X X，DING X Y，CHU B H，et al.Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale Kimura et Migo(Orchidaceae)based on AFLP［J］.Gentica，2007，10:9 196－9 198.

［19］丁 鸽，丁小余，沈 洁，等.铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别［J］.药学学报，2005，40(11):1028－1 032.

［20］AMMIRAJU JSS，DHOLAKIA B B，SANTRA D K，et al.Identificat ion of inters imple sequence repeat(ISSR)markers associated with seed size in wheat［J］.Theor Appl Genet，2001，102:726－728.

［21］CASASOH M，MATTIONI C，CHERUBIN A，et al.A geneti c linkage map of European chestnu(Castanea sativa Mill.)based on RAPD、ISSR and isozyme markers［J］.Theor Appl Genet，2001，102:1 190－1 193.

［22］邱英雄，傅承新，吴斐捷.明党参与川明参群体遗传结构及分子鉴定的ISSR分析［J］.中国中药杂志，2003，28(7):598－601.

［23］李海生，陈桂珠，施苏华.海南海桑遗传多样性的ISSR研究［J］.中山大学学报(自然科学版)，2004，43(2):67－69.

［24］何华勤，贾小丽，梁义元.RAPD和ISSR标记对水稻化感种质资源遗传多态性的分析［J］.遗传学报，2004，31(9):888－891.

［25］JIN Y，ZHANGW J，FU D X，et al.Sampling strat egy within a wild soybean population based on its genetic variat ion detected by ISSR markers［J］.Acta Botanica Sinica，2003，45(8):995－998.

［26］LI H S，CHEN G ZH.Genetic diversity of Sonneratia alba in China detected by inter－simple Sequence repeats(ISSR)analysis［J］.Acta Botanica Sinica，2004，46(5):515－520.

［27］卢家仕，卜朝阳，吕维莉，等.20份兰科植物的ISSR遗传多样性分析［J］.西南农业学报，2012，25(6):2 252－2 257.

［28］沈 洁，丁小余，丁 鸽，等.铁皮石斛居群差异的研究ISSR指纹标记方法的建立与优化［J］.中国中药杂志，2006，31(4):291－294.

［29］卢家仕，卜朝阳，吕维莉，等.不同产地石斛属种质资源的ISSR遗传多样性分析［J］.中草药，2013，44(1):96－100.

［30］汪 尚.铁皮石斛种质资源遗传多祥性评价及其遗传连锁图谱的构建［D］.杭州:杭州师范大学，2012:27－45.

［31］徐旭栋，蒋瑞彬，蓝小明，等.人工栽培铁皮石斛种质资源遗传多样性的SCoT分析［J］.中华中医药杂志，2013，28(7):2 123－2 125.

［32］赵瑞强.2012.基于分子标记的皮石斛种质资源遗传多样性研究［D］.杭州:浙江农林大学，2012:13－52.

［33］薛勇彪，段子渊，种 康，等.面向未来的新一代生物育种技术——分子模块设计育种［J］.现代农业，2013，28(3):203－314.

［34］HUANG X H，WEI X H，SANGT.et al.Genome－wide association studies of 14 agronomic traits in rice land－races.Nature Genetics，2010，42:961－967.

［35］HUANG X，QIAN Q，LIU Z，et al.Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice.Nature Genetics，2009，41:494－497.

［36］LI X，QIAN Q，FU Z.et al.Control of tillering in rice.Nature，2003，422:618－621.

［37］JIAO Y，WANG Y，XUE D.et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.Nature Genetics，2010，42:541－544.

［38］孟衡玲，段承俐，萧凤回，等.铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析［J］.中国中药杂志)，2011，36(7):833－837.

［39］曾淑华，文国松，徐绍忠，等.铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析［J］.中草药，2012，43(4):766－771.

［40］ZHAO P，WANG W J，SUN M X.Characterization and expression pattern analysis of DcNAC gene in somatic embryos of Dendrobium candidum Wall ex Lindl［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult，2011，107:151－159.

［41］ZHANG G，SONG C，ZHAO M M，et al.Characterization of an A－type cyclin－dependent kinase gene from Dendrobium candidum［J］.Biologia，2012，67(2):360－368.

［42］PARNISKE M.Arbuscular mycorrhiza:The mother of plant root endosymbioses［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6:763－775.

［43］李 光，路 娟，陈 曦.铁皮石斛产业发展存在的问题与对策［J］.中国中药杂志，2013，38(4):469－471.

［44］吴韵琴，斯金平.铁皮石斛产业现状及可持续发展的探讨［J］.中国中药杂志，2010，35(15):2 033－2 036.

［45］张 岗，张大为，赵明明，等.铁皮石斛分子生物学研究进展［J］.中国药学杂志2013，48(19):1 614－1 619.