免疫学技术在食品过敏原检测中的应用

胡骁飞，王 耀，邓瑞广，张改平,3,*

免疫学技术在食品过敏原检测中的应用

胡骁飞1，王 耀2，邓瑞广1，张改平1,3,*

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；3.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002）

食品过敏原可引起机体产生过敏反应，严重危害人类健康及生命安全。目前食品包装上过敏原信息标注规范尚不完善，因此食品过敏原检测技术对于预防含有过敏原食品进入流通领域，减少过敏事件发生至关重要。本文综述了免疫学检测技术在食品过敏原检测中应用，并展望了其未来的发展趋势。

食品过敏原；免疫学技术；检测

民以食为天，食以安为先。食品安全与人民的身心健康和生命安危密切相关。随着食品生产的集中化和机械化，以及新技术的广泛使用，食品安全问题在过去的十几年间不断涌现，世界各地均有严重的食品安全事件爆发。食品安全已成为世界性的话题，同时各国政府和消费者对食品安全问题也给予了空前的关注。食品安全问题种类众多，除了近几年关注较多的违禁添加、农药残留、兽药残留、重金属残留、霉菌毒素污染及致病性病原微生物污染等问题之外，食品自身所含的一些致敏性物质引起的食物过敏也是一种较为严重的食品安全问题，严重危害着过敏人群的身体健康。目前食物过敏的流行已经成为食品行业的巨大挑战。世界卫生组织将过敏症定为全球排名第四的慢性疾病，食物过敏作为过敏症中重要的一种，已成为一个世界性的健康问题，并且逐渐成为大家关注的焦点。为了防止食品过敏原对过敏人群产生的健康危害，避免消费者出现食物过敏反应，对食品中所含的过敏原进行定性定量检测至关重要。在过敏原的检测和分析过程中免疫学技术扮演着十分重要的角色，本文对免疫学技术在食品过敏原检测中的应用进行了介绍，并对以后的发展方向进行了探讨。

1 食物过敏概述

食物过敏是机体对于食物或食物成分的免疫异常反应，免疫系统的参与使其区别于其他类型的食物敏感。引起机体发生食物过敏的成分称为食品过敏原。根据Gell等[1]的分类，大多数食物过敏属于由IgE介导的速发型超敏反应（Ⅰ型超敏反应）[2]，其免疫机制包括致敏和发敏两个阶段，易感个体对于一定量的过敏原诱导可产生大量的IgE抗体，IgE抗体进入血液循环，并迅速与肥大细胞、嗜碱性粒细胞膜表面的Fc受体结合，成为这些细胞表面的过敏原特异性受体，从而使机体处于致敏状态。当机体再次接触含相同或相似过敏原成分的食品时，过敏原特异性识别致敏细胞膜表面的IgE，诱导细胞脱颗粒释放血管活性胺（如组胺）和其他炎症介质而触发食物过敏反应。

食物过敏反应会对人体造成不同程度的危害。研究表明，对于高度敏感的人群，摄入微量的过敏原就可以引发机体的消化系统病症（如呕吐、腹泻等）、呼吸病症（如鼻炎、哮喘等）、循环系统病症（如水肿、低血压等）和皮肤病症（如荨麻疹、过敏性皮炎、湿疹等）等局部反应；对某些个体，特定的食品过敏原甚至可以引起 致命的全身反应（如过敏性休克）[3-4]。目前已有160多种食物可以引起过敏反应，其中，牛奶、鸡蛋、花生、小麦、大豆、坚果、鱼类和贝类8种食物所引起的过敏反应占到了所有食物过敏的90%以上[5]。据统计，这8种食物导致美国儿童发生过敏反应的概率分别约为2.5%、1.3%、0.8%、0.4%、0.4%、0.1%、0.2%和0.1%[6]。近些 年，因食物过敏出现危及生命的反应呈增加趋势，食物过敏在世界范围内已成为一个重要的健康问题[7]。在西方国家，约有8%的儿童和2%的成人会发生食物过敏[7-8]；在我国，杭州市 区0～3岁儿童食物过敏率为4.85%[9]，攀枝花市0～3岁儿童食物过敏率为7.58%[10]，中国医科大学统计15～24岁年龄段健康人群中约有6%的人存在食物过敏[11]。

食品安全性是食品质量最重要的组成部分，而食物过敏严重危害食品安全性，已引起了各国食品安全监督管理部门的重视。目前，严格对食品过敏原进行标注已成为一种重要的发展趋势，一些发达国家为保护食物过敏人群，专门立法规定食品包装上要标注食物过敏原，我国在2012年实施的食品安全国家标准GB 7718—2011《预包装食品标签通则》中也推荐食品包装上标注致敏物质。但随着食品加工业的飞速发展，食品多样化凸显，深加工和精加工食物过敏成分的标注措施仍不完善，使食物过敏患者难以选择。因此，针对食品过 敏原的检测技术对预防食品过敏意义重大，而快速、简便的免疫学检测技术对预防食品过敏尤为重要。

2 食品过敏原的免疫学检测技术

食品过敏原多为蛋白质，具有紧凑的三维结构、配位键、二硫键以及糖基化，这些结构特点都使其在酸、碱、加工等处理时保持结构的稳定性[12]。而且，食品原料成分较多，其中存在的食品过敏原含量相对于其他原料往往很低，这些因素增加了快速、准确、定量检测过敏原的难度。

免疫学检测技术是基于抗原抗体特异性反应建立的检测技术。该技术具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确对抗原物质进行定性定量检测，并且不需要复杂的程序和价格高昂的仪器，因此，在食品安全检测领域得以广泛应用，并衍生出多种检测方法。

2.1 免疫印迹（immunoblotting）

免疫印迹在过敏原的检测中应用较早，并且广泛应用于发现和鉴定新的过敏原[13]。该法又称为蛋白质印迹（western blotting），是将十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和固相免疫测定技术相结合。其原理是首先将样品在进行单向或双向凝胶电泳，抗原蛋白根据其分子质量大小分离，然后将分离的蛋白在电场力的作用下转移到固定化基质膜上，最后利用放射物质或者酶标记的抗体对膜进行检测和分析。Gagnon等[14]将免疫印迹和质谱技术相结合，用大豆过敏患者的血清检测出了19种大豆过敏原，包括5种新过敏原。Satoh等[15]将转基因大米和非转基因大米中提取的蛋白进行了单向和双向电泳，并进行免疫印迹分析，结果表明转基因并没有改变大米中原有的过敏原，也没有产生新的过敏原。虽然免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的特异性和敏感性，但目前该方法仅可用于过敏原的定性或半定量检测。

2.2 火箭免疫电泳（rocket immuno-electrophoresis，RIE）

RIE的特点是使用含有抗体的凝胶进行过敏原的检测，被检测的过敏原根据自身的电泳迁移率移动直到形成抗原抗体复合物在凝胶中沉淀，电泳图片中显示的火箭形状的高度与被检测的过敏原的量成正比。Yman等[16]在分析食品中的蛋白质时利用了该方法，验证是否含有过敏原或过敏原标示错误。Holzhauser等[17]利用花生蛋白的抗血清进行RIE，在两种没有标明花生成分的食品中检测出了花生蛋白。但该方法在过敏原的检测中并没有得到广泛应用，主要由于含抗体凝胶的制备比较繁琐，而且染色过程较为复杂。

2.3 斑点免疫印迹（dot immunoblotting）

斑点免疫印迹的原理是首先将提取的蛋白样品点在硝酸纤维素或者聚偏二氟乙烯膜上，然后用酶标抗体孵育，最后加入底物反应显色后形成有色的可视斑点，斑点的强度与过敏原的含量成正比。其中酶标抗体也可以用放射性物质标记抗体代替，最后用射线照相进行分析。Blais等[18]将涤纶布作为样品膜，用该方法检测了多种食品中的花生蛋白，部分阳性样品中花生蛋白的含量小于1mg/L。虽然该方法是一种操作简单而且廉价的检测方法，但仍只适用于食品中过敏原的半定量检测。

2.4 放射/酶联过敏原吸附抑制实验（r adi oallergosorbent/enzyme-allergosorbent inhibition test，RAST/ EAST Inhibition）

RAST和EAST通常用于食物过敏的临床诊断，而RAST/EAST抑制实验已被应用于过敏原的定性检测以及食物中潜在过敏原的评估[19-20]。该方法的原理是首先将能与人体特异的IgE抗体结合的过敏原固定在固相载体上，然后加入被测样品，样品溶液中的过敏原会抑制固相载体上的过敏原与IgE结合，最后加入用放射性物质或酶标记 的抗IgE抗体，再加入发光或显色的底物，用射线计数器或分光光度计来检测结合的IgE，从而间接的检测样品中的过敏原。Herian等[21]利用RAST抑制实验定性检测了多种大豆制品（豆芽、豆豉、豆腐、豆酱、酱油等）的过敏原性，结果表明这些大豆制品都会对大豆过敏人群造成潜在的危害。Fremont等[22]利用RAST抑制实验证明了婴儿食用的谷物面粉中添加的乳糖成分中含有1～5μg/g的过敏原α-乳白蛋白，表明需要对食品过敏原信息进行详细标注，以降低潜在的食物过敏风险。Paschke等[23]利用EAST抑制实验检测比较了精炼大豆油、非精炼大豆油和大豆卵磷脂的过敏原性，结果显示可能是由于精炼过程中的热处理，消除了精炼大豆油的过敏原性。由于RAST/EAST抑制实验依赖于合适的过敏人群血清并且很难建立标准的检测方法，所以该方法在食品过敏原定量检测中的应用有一定的局限[24]。

2.5 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

目前，ELISA方法是实验室、食品企业以及食品监管机构检测食品中过敏原最常用的方法[25]。该方法主要是基于抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记，固相化的抗原或抗体可以保持其免疫学活性，酶标记物在保持其免疫学活性的基础上也保留了酶的活性。常用于食品中过敏原定量检测的ELISA方法主要有竞争ELISA（competitive ELISA）和夹心ELISA（sandwich ELISA）两种。竞争ELISA是将过敏原固定在微孔板上，与样品中的过敏原竞争结合特异抗体；而夹心ELISA基于食品过敏原具有多抗原决定簇的特点，先将过敏原的一种特异抗体固定在微孔板上，与样品中的过敏原结合后，然后加入另一种酶标记的特异抗体与过敏原结合。这两种方法均具有实用性强、特异性高、敏感性强等优点。

Ecker等[26]利用兔多抗和鸡多抗建立了夹心ELISA方法检测饼干和面条中的羽扇豆蛋白，该方法准确性高、特异性好，在不同基质中检测限为0.4～2.3mg/kg。Ma Xi等[27]在获得大豆球蛋白单克隆抗体的基础上建立了竞争ELISA检测方法，该方法的半数抑制浓度（IC50）为1.7μg/L，检测限为0.3μg/L。Hei Wenjing等[28]用鼠源单克隆抗体作为包被抗体，用兔源多克隆抗体作为二抗建立了检测β-伴大豆球蛋白的夹心ELISA方法，该方法的检测限为1.63μg/L，线性范围为3～100μg/L。

目前，市场上已经有一些商品化的ELISA检测试剂盒，专门用于检测食品中的过敏原，可在1～2 h内对过敏原进行定性和定量检测[29]。虽然ELISA方法有诸多优点，但有时因为食品基质干扰，也会对检测结果造成影响。

2.6 侧流免疫层析法（lateral-flow immunochromatography assay，LFA）

LFA是20世纪50年代形成的一种技术[30]，它的基础是乳胶凝集实验。近年来，LFA已发展成为一种重要的检测方法，结合胶体金标记技术及其他标记技术，这种方法已被开发出多种多样的商业化的检测试纸条。其原理是将抗原或抗体固定于NC膜检测区域，然后通过毛细管作用，使样品沿着该膜向前移动，当移动至检测区域时，样品中相应的抗体或抗原就会在此区域发生特异性结合，若用胶体金标记可使检测区域显示颜色，从而进行特异性的免疫检测。Koizumi等[31]制备并验证了一种胶体金免疫层析试纸条，用于检测加工食品中的甲壳类动物蛋白质，该方法灵敏度高，检测虾蛋白的目测检测限为25μg/L。类似胶体金的其他纳米颗粒也可以应用于LFA的标记材料，例如Zheng等[32]将超顺磁纳米颗粒与单克隆抗体偶联，研制了一种能够定量检测鱼主要过敏原小白蛋白的免疫层析试纸，该试纸的检测线性范围为0.01～100mg/L。侧流免疫层析法的检测时间比其他免疫学方法大大缩短，可在数分钟内得到实验结果，该方法还具有便携、经济的特点，而且操作简单，不需要任何仪器，可以实现现场实时检测，因而在食品安全监控领域得到广泛的应用。但该方法多为半定量检测，仍有进一步发展的空间。

2.7 时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoreimmuo assay，TRFIA）

TRFIA是20世纪80年代迅速发展起来的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术。TRFIA是用具有特殊荧光的镧系离子与螯合剂结合作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体等，在一定的反应体系（如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生反应后，用时间分辨荧光仪测定产物中的特异荧光强度，推测反应体系中分析物的浓度，从而达到对待测物质进行定量分析的目的[33]。Faeste等[34]用铕的螯合物的荧光特性来提高信噪比，建立了TR FIA方法来检测食品中的榛子蛋白，该方法检测限可以达到0.1mg/kg。TRFIA技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、测定范围宽、试剂寿命长、操作简便和非放射性等特点，但需要仪器进行荧光强度测定。

2.8 免疫传感器检测技术

免疫传感器检测技术是通过实时监测识别元件表面的抗原抗体反应，将传统的免疫测试结果通过传感器转换为精密的数字输出，从而达到分析和检定量测的目的[35]。表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器是目前的一个研究热点，其原理是将配体分子预先固定在金属表面上，待分析样品通过样品通道与配体特异性结合形成复合物，当被分析物与配体分子结合后，共振峰的位置会发生位移，该位移的大小将反映固定在金属表面的物质的量，进而监测分子间相互作用，这样就达到了实时监控配体与待分析物的吸附和解吸完整的反应过程[36]。Pollet等[37]利用光纤SPR传感器快速准确地检测花生过敏原，该传感器利用磁性纳米颗粒增强了传感信号，将检测限提高到了 0.09g/mL。Billakanti等[38]应用SPR传感器对加工和未加工过的牛乳样品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和IgG 5种蛋白质进行了检测，平均含量分别是0.8、4.0、0.21、0.12mg/mL和0.48mg/mL，结果与液相色谱和ELISA检测结果相一致。免 疫传感器技术具有快速、高灵敏和高特异等优点，未来可将其与微阵列相结合，高通量地对过敏原进行定量分析。

3 结 语

综上所述，随着人们对食品安全的重视，新型快速的食品过敏原检测技术必将成为研究热点，而免疫学检测技术则成为其中的重点。免疫印迹、火箭免疫电泳、斑点免疫印迹和放射/酶联过敏原吸附抑制实验4种方法由于操作繁琐、不能准确定量、依赖过敏人群血清等自身的局限因素，未能在食品过敏原检测方面得到长足的发展，但仍可作为辅助的检测方法。目前，国内外应用较为广泛的主要是酶联免疫吸附实验、侧流免疫层析法、时间分辨荧光免疫法和免疫传感器检测等方法。但这些方法也存在一些亟需解决的问题：一方面由于食品过敏原种类较多，检测过程中可能会发生交叉反应；另一方面，现有方法可能会存在基质干扰，影响检测结果。因此需要针对单一过敏原制备出敏感性高、特异性强的抗体。同时还需要研究建立即简单便捷，又能减小基质干扰的样品处理新技术，以增加检测的灵敏度和准确性。

随着贸易全球化的发展，不同国家和地域的食品也会相互流通，过敏人群接触食品过敏原的种类和机会也大大增加。为有效避免食品过敏原对过敏人群造成的食品安全隐患，除了在食品包装上对食品过敏原进行严格标注，为过敏人群提供警示信息之外，将免疫学检测技术与其他方法相结合，研发出高通量、高灵敏、高特异、经济快速、简便的食品过敏原检测方法也势在必行。

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Application of Immunological Techniques in Detection of Food Allergens: A Review

HU Xiao-fei1, WANG Yao2, DENG Rui-guang1, ZHANG Gai-ping1,3,*
(1. Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The allergic reactions caused by food allergens are threatening human health and life. Currently, allergy information on the packaging of food products is imperfect. Thus, development of technologies to detect food allergens is critical to prevent all ergy-causing foods from entering into circulation and to reduce the occurrence of allergic incidents. This review summarizes recent applications of immunological technologies in the detection of food allergens, and discusses future prospects in this field.

food allergens; immunological techniques; detection

R392.8

A

1002-6630（2014）08-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201408001

2014-03-30

河南省基础与前沿技术研究计划项目（132300413222）

胡骁飞（1972—），男，副研究员，博士，研究方向为食品安全检测技术。E-mail：huxf1972@126.com

*通信作者：张改平（1960—），男，中国工程院院士，教授，博士，研究方向为动物病毒分子致病机制和食品安全检测。E-mail：zhanggaiping2003@163.com