ISSR分子标记在棉花遗传育种上的应用

宋志红, 孟庆忠, 张 涛, 张胜昔, 王贵春, 李国荣

湖北省农业科学院经济作物研究所, 农业部长江中游棉花生物学与遗传重点实验室(武汉), 武汉 430064

ISSR(inter-simple sequence repeat)是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记，即简单序列重复区间扩增多态性分子标记[1,2]。该技术具有引物设计容易、操作简单、成本低、可重复性高和不使用同位素等特点。目前，应用该技术在水稻[3]、小麦[4]和玉米[5]等作物上开展了品种鉴定、遗传多样性分析及指纹图谱的构建等工作。本文简要介绍ISSR标记技术的原理、特点及其在棉花遗传育种中的应用，并对ISSR标记技术在棉花研究中存在的问题和应用前景进行了探讨。

1 ISSR分子标记

1.1ISSR分子标记的原理

简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)或短串联重复(short tandem repeats，STR)，指以少数几个核苷酸(1～4个)为单位多次串联重复的DNA序列[1]。它们在植物基因组中大量分布。简单重复间序列标记 (inter simple sequence repeat，ISSR)的基本原理是在SSR的3′或5′端锚定1～4个碱基作引物，进行PCR反应，锚定引物可以引起特定位点退火，引发与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断的扩增，所扩增的条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳进行检测，以此结果进行多态性分析[6]。

1.2ISSR分子标记技术的特点

ISSR分子标记技术无需基因文库构建、杂交和同位素显示等步骤，操作更加简单、快速和高效；遗传多态性高，重复性好，稳定性较高；另外，结合RAPD和SSR技术标记的优点，样品需求量少，模板DNA用量少。不足之处在于需要确定最佳反应条件；且呈显性遗传标记，不能区分显性纯合和杂合基因型；ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域，而导致无扩增产物出现[7]。

2 ISSR技术在棉花遗传育种中的应用

ISSR分子标记是植物进行种质鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及标记辅助选择育种等方面研究的有效手段[8]，ISSR分子标记在棉花中的研究，对其遗传育种起到了重要的指导作用，为棉花分子育种积累了一定的理论基础。

2.1遗传多样性及亲缘关系分析

农业起源和发展的基本前提是拥有种质资源，改良品种、选育新品种及遗传生物学研究都需要以遗传变异和基因资源丰富的种质资源为基础。遗传多样性和亲缘关系分析是植物种质资源研究和评价的主要内容之一。ISSR分子标记技术能够检测出品种间微小的差异，因此，被广泛应用于植物的种质资源遗传多样性的研究[9]。

国内学者利用ISSR分子标记主要对国内外不同地区棉花的种质资源进行了分析。苏亚蕊等[10]利用ISSR分子标记分析了开封市农业科学研究所的48份陆地棉种质资源的亲缘关系及遗传多样性。引物平均多样性信息指数(polymorphism information content，PIC)和多态性谱带百分率(percentage of polymorphic bands，PPB)分别为0.76％和87.88％。ISSR标记揭示出这48份棉花种质资源遗传多样性较低，遗传基础比较狭窄。刘新浩等[11]利用6个ISSR引物对23个棉花资源品系进行遗传多样性检测，聚类分析表明，在遗传距离GD值0.63水平上将23个棉花品种可聚成两大类。品种间遗传距离GD变幅为0.13 253～0.67 717。结果显示出这23个棉花品种遗传变异较大，遗传基础宽阔。武耀廷等[12]利用RAPD、SSR和ISSR 3种分子标记方法和两年田间实验将国内外36个陆地棉栽培品种大致分为国外品种、新疆品种、早熟类型品种和我国的中熟棉品种等几个类群。姜伟等[13]采取ISSR分子标记对48份棉花种质资源(河南、河北、山东、新疆、广东和美国等)的遗传多样性进行分析，多态率达83.70％。将48个种质资源划分为4个大类(GS=0.55)。以上研究表明，ISSR具有丰富遗传多样性和稳定性，是一种较好的遗传分子标记，适宜于棉花品种遗传多样性分析。

国外学者利用ISSR分子标记研究棉花种质资源遗传多样性及亲缘关系分析主要包括不同棉花基因型分析、杂交后代(F1、F2)分析、抗病抗虫资源分析及不同分子标记系统的对比等。Bardak等[14]利用39个SSR和5个ISSR标记引物来标记25个基因型棉花品种(二倍体和四倍体基因型棉花)。遗传多样性值的范围为0.04～0.58。分析证明商业品种的遗传多样性比较低，应引入野生型棉花种质资源库来增加遗传多样性。Sharaf等[15]用RAPD、ISSR和AFLP 3种标记研究了7个棉花基因型(包括3个埃及棉品种、3个叙利亚的陆地棉品种和1个美国三角洲松棉品种)间的遗传变异和亲缘关系，3种RAPD、ISSR和AFLP引物标记检测的多态性分别为71.81％、88.57％和50.52％。基于3种标记及组合的数据将7个棉花品种分为两个主要的集群(陆地棉的4个基因型棉花和海岛棉3个基因型棉花)。Noormohammadi等[16]用30个RAPD引物和8个ISSR引物研究了棉花bellizovar和tabladilla的杂交后代F1和F2的遗传多样性。30个RAPD引物共检测到191条带，其中63条为多态带。8个ISSR引物检测到86条带，其中27条为多态、59条为单态。一些条带在F1后代出现而在同一基因型的F2后代缺失。聚类分析将Siokra×belilzovar的F1和F2代分为一组。Noormohammadi等[17]用10个ISSR引物研究了陆地棉棉花品种Mehr及其杂交后代的分子遗传多样性。其多态性为54.35％。ubc834引物显示最高有效等位基因数、多样性指数和遗传多样性。另外有一些ISSR带只出现在亲本基因型中，而另一些ISSR带仅出现在杂交基因型中。Noormohammadi等[18]用30个RAPD引物和10个ISSR引物来评估四倍体杂交棉F2群体基因型的遗传多样性(陆地棉)。30个RAPD引物多态性为66.44％，10个ISSR引物多态性为67.82％。基于ISSR数据分析，杂交品种Mehr×tabladila和tabladila×Siokra表现出最低的遗传相似系数0.59，而杂交品种No.200X×belilzovar和tabladila×sindose表现出最高的遗传相似系数。研究表明，利用RAPD和ISSR数据可提供杂交基因型高分辨率的分子分布。Donger等[19]利用40个RAPD和19个ISSR引物探讨了24个陆地棉种质资源(12个抗白叶枯病、12个抗叶蝉和棉铃虫)的遗传多样性。RAPD和ISSR标记的聚类相似系数分别为0.55～0.94和0.39～0.98。RAPD和ISSR多态性的平均值分别为68.68％和76.55％，说明ISSR标记比RAPD可提供更多的信息。Adawy等[20]利用AFLP、ISSR、RAPD和SSR先后分析了两个棉花基因型之间的遗传多态性，探讨不同标记系统的效率，结果表明，不同的标记系统检测多态性的机制、基因组的覆盖范围和应用的难易程度不同。因此，这些分子标记可以相互补充，得出更准确的结论。

2.2种质鉴定

DNA指纹图谱(DNA fingerprinting)技术是目前种质资源收集和种质鉴定中一项非常重要的技术，可对种质资源进行评估，以及对品种真实性和纯度进行鉴定。目前品种鉴定主要是通过分子标记技术获得品种的指纹图谱，而ISSR分子标记技术由于其稳定可靠、重复性好和多态性丰富等优点在种质鉴定中将会越来越重要[8]。

国内外运用ISSR标记技术进行棉花品种鉴定的研究还很少。姜伟等[21]从60条ISSR条引物中筛选到11条扩增效果好的引物，用其中2条引物UBC809和UBC841首次建立了8个品种的指纹图谱，可将8个棉花品种互相区别。

2.3遗传图谱构建、基因定位及标记辅助选择育种

ISSR分子标记技术因具有较高的准确性、重复性和高度多态性，且分布在整个染色体上，被广泛应用于绘制遗传连锁图谱和基因定位[22]。袁有禄[23]用221对SSR引物、1 840个RAPD引物和77个ISSR引物对棉花亲本纤维强度、麦克隆值(micronaire)和长度极值库筛选后得到了15个标记，其中12个标记分成了3个连锁群，并检测到一个高强纤维的主效QTLs。Abdi等[24]研究了28个棉花品种(包括8个伊朗棉花品种)的耐盐性(NaCl)。用14个ISSR引物产生65个多态性DNA片段。根据ISSR标记将28个棉花品种分为三群(耐盐害品种、盐害敏感品种和中间品种)，并且找到与盐害(NaCl)处理相关的3个分子标记。这些标记可能帮助育种者进行辅助选择育种，以提高棉花品种对盐胁迫的耐受性。

3 问题与展望

ISSR分子标记已在棉花遗传多样性研究、亲缘关系分析、种质鉴定、遗传图谱构建和标记辅助育种等方面取得了较大进展，但与其他作物相比，还存在诸多问题和不足。ISSR 分子标记在棉花上的研究多局限在棉花遗传多样性研究及亲缘关系分析上，并且国内研究落后于国外研究。国内学者仅对国内外不同地区棉花的种质资源进行了分析，国外学者则在不同棉花基因型分析、杂交后代(F1、F2)分析、抗病抗虫资源分析及不同分子标记系统的对比等方面都有研究，因此，国内学者未来可开展相应的研究，拓宽ISSR分子标记技术在棉花遗传多样性研究及亲缘关系分析上的应用。在种质鉴定方面，利用ISSR分子标记已经在其他作物的种质鉴定中有成功应用，例如，Charters和Wilkinson[25]运用ISSR技术，仅用6条引物就能将62个可可种质资源的样品中的56个区分开； Kumar等[26]成功运用ISSR分子标记技术鉴定了4个有争议的辣椒(Capsicumannum)品种，是运用DNA分子标记方法来维护育种者权利的首次尝试。因此，ISSR分子标记技术必将在棉花种质资源评估及品种真实性和纯度鉴定中发挥重要作用。在遗传图谱构建方面，迄今，国内外已发表的棉花种间分子遗传图谱的分子标记有RFLP、AFLP、SSR、EST-SSR、REMAP和SRAP等标记[27]，而利用ISSR标记技术对棉花进行遗传图谱构建与基因定位的研究还较少。近十年来，利用分子标记对棉花遗传图谱的研究工作已经深入展开，但现有棉花遗传连锁图还存在图谱所用的标记数较少、基因组覆盖率不高且分布不均匀、存在标记间距离过大或有些染色体上没有标记等问题[27]。ISSR标记由于遍布整个基因组且高度多态性的特点，能够成为绘制遗传连锁图的理想标记。但ISSR由于显性标记的特点，应用于遗传图谱构建存在不足，在研究中结合其他共显性的分子标记如SSR或SCAR，才能更好地解决遗传作图、基因定位等工作中的问题。例如，Doucleff等[28]利用了32个RAPD、9个SSR和24个ISSR引物的3种分子标记方法构建了葡萄的遗传连锁图。因此，今后棉花遗传图谱研究中，可利用ISSR标记和其它分子标记技术联合来共同构建，以丰富棉花遗传图谱。

DNA分子标记技术的发展使其成为棉花分子遗传及辅助育种研究的重要工具[29]。在棉花遗传育种中，如何发挥ISSR分子标记在植物遗传和辅助育种研究应用中的诸多优点[30]，有待进一步的加强研究以推动棉花遗传育种进程。

[1]Zietkiewiez E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics, 1994，20(2)：176-183.

[2]Wu K S，Jones R，Dannebergerger L，etal.. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning[J]. Nucleic Acids Res.，1994，22(15)：3257-3258.

[3]Nagaraju J，Kathrivel M，Kumar R R，etal.. Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2002，99(9)：5836-5841.

[4]Ammiraju J S S，Dholakia B B，Santra D K，etal.. Identification of inter simple sequence repeat(ISSR) markers associated with seeds in wheat[J]. Theor. Appl. Genet.， 2002，102：726-732.

[5]Gupta M，Chyi Y S，Romero-sevenson J，etal.. Amplification of DNA marker from evolutionarily diverse genomes using singlerimers of simple-squenee repeats [J]. Theor. Appl. Genet.，1994，89(7-8)：998-1006.

[6]周延青. DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社，2005.

[7]赵 英. 分子标记在芒果上的应用研究[J]. 农业研究与应用，2013，148(5)：19-23.

[8]王建波. 分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J].遗传 ，2002，24(5)：613-616.

[9]朱岩芳，祝水金，李永平，等. ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J]. 种子， 2010，29(2)：55-59.

[10]苏亚蕊，刘新浩，李锁平. 棉花种质资源多样性的ISSR聚类分析及主成分分析[J]. 河南大学学报：自然科学版，2012，42(2)：401-406.

[11]刘新浩，汤玉煊，李军华，等. 棉花资源品系的遗传多样性分析[J]. 中国棉花，2011，38(1)：11-13.

[12]武耀廷，张天真，殷剑美. 利用分子标记和形态学性状检测的陆地棉栽培品种遗传多样性[J]. 遗传学报，2001，28(11)：1040-1050.

[13]姜 伟， 朱宏波， 何觉民. 不同来源棉花种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 棉花学报，2008，20(5)：348-353.

[14]Bardak A，Bolek Y. Genetic diversity of diploid and tetraploid cottons determined by SSR and ISSR markers[J]. Turkish J. Field Crops，2012，17(2)：139-144.

[15]Sharaf A N，Elkadi D A，Alatwani H F，etal.. Genetic studies on some cotton genotypes using DNA molecular markers[A]. In: 4th Conference on Recent Technologies in Agriculture[C]2009，167-178.

[16]Noormohammadi Z，Al-Rubaye M S，Sheidai M，etal.. ISSR，RAPD and agronomic study in some F1and F2cotton genotypes[J]. Acta Biol. Hung.，2011，55(2)：219-225.

[17]Noormohammadi Z，Shojaei-Jesvaghani F，Sheidai M，etal.. Inter simple sequence repeats (ISSR) and randomamplified polymorphic DNA (RAPD) analyses of geneticdiversity in Mehr cotton cultivar and its crossing progenies[J]. Afr. J. Biotechnol.，2011，10(56)：11839-11847.

[18]Noormohammadi Z，Shamee M，Sheidai M，etal.. The comparison of inter simple sequence repeat and randomly amplified polymorphic DNA markers for genetic assessment of intra-specific cotton hybrid genotypes[J]. Gene conserve，2011，42：270-292.

[19]Dongre A B，Bhandarkar M，Banerjee S. Genetic diversity in tetraploid and diploid cotton (Gossypiumspp.) using ISSR and microsatellite DNA markers[J]. Indian J. Biotechnol.，2007，16(7)：349-353.

[20]Adawy S S，Hussein E H A，ElItriby H A. Molecular characterization and genetic relationships among cotton genotypes 2-AFLP analysis [J]. Arab J. Biotechnol.， 2006， 9(3)：477-492.

[21]姜 伟，李雪源，何觉民，等. 新疆8个棉花品种(系)的指纹图谱分析[J]. 华北农学报，2007， 22(B10)：89-92.

[22]王 超，张智勇，陈永胜,等. ISSR分子标记技术及其在蓖麻遗传育种中的应用[J]. 黑龙江农业科学，2012，(9)：14-17.

[23]袁有禄. 棉花优质纤维特性的遗传及分子标记研究[D]. 南京：南京农业大学，博士学位论文， 2000.

[24]Abdi A A，Sofalian O，Asghari A. Inter-simple sequence repeat (ISSR)markers to study genetic diversity among cotton cultivars in associated with salt tolerance[J]. Notulae Scientia Biologicae，2012，4(4)：120-126.

[25]Charters Y M，Wilkinson M. The use of self-pollinated progenies as‘in-group’for the genetic characterization of coco germplasm[J]. Theor. Appl. Genetics， 2000，100(1)：160-166.

[26]Kumar L D，Kathirvel M，Rao G V. DNA profiling of disputed chili samples(CapsicumannumL)using ISSR-PCR and FISSR-PCR marker assays[J].Forensic Sci. Int. ，2001，116(1)：63-68.

[27]张 轲，张正圣. 棉花遗传连锁图谱及其应用研究进展[J]. 棉花学报，2008，20(6)：460-469.

[28]Doucleff M，Jin Y，Gao F，etal.. A genetic linkage map of grape，utilizingVitisrupestrisL. andVitisarizonicaL.[J].Theor. Appl. Genet.，2004，1(6)：1178-1187.

[29]赵兴华，渠云芳，黄晋玲. 分子标记技术在棉花育种中的应用[J]. 山西农业科学，2011， 39(6)：611-615.

[30]赵 谦，杜 虹，庄东红. ISSR分子标记及其在植物研究中的应用[J]. 分子植物育种，2007， 5(6S)：123-129.