生物体中PAEs和AEs检测技术及安全评价研究进展

蔡 艳， 贺小雨， 杨震峰＊， 苏新国

1.浙江万里学院生物与环境学院，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 宁波 315100；

2.宁波市出入境检验检疫局，浙江 宁波 315012；

3.广东食品药品职业学院，广州 510520

邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs，又称酞酸酯）和己二酸酯（adipate acid esters，AEs）是众所周知的聚合物添加剂，它们在改变聚合物的性质、聚合物的加工及产品性能等方面发挥着巨大作用，因此，在20世纪30年代以后被当作增塑剂广泛添加于日用及工业的高分子塑料产品及包装材料中。作为增塑剂，PAEs和AEs与塑料分子以氢键或范德华力连接，而并非共价聚合，为塑料产品提供了必要的可塑性。但由于全球塑料制品的大量使用和时间的推移，PAEs和AEs从塑料分子中溶解出来，造成环境的污染［1］。目前，PAEs和AEs在全球的生态环境中已达到了普遍检出的程度，在空气、土壤、水体、食品，甚至在生物体中均检测到了 PAEs和 AEs的存在［2，3］。

由于PAEs和AEs具有亲脂性、残留期长及难以降解等特点，会通过食物链逐级传递并富集，最后以较高的浓度蓄积在人体或动物体内［3，4］。近年来的动物实验显示，极微量的PAEs和AEs即会干扰生物体内激素的分泌，造成动物生殖扰乱，包括精囊萎缩、精子数量减少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、体重下降、子宫粘膜组织增生等［5］。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种常见PAEs类增塑剂，现已发现DEHP会影响小鼠体内的过氧化物酶的合成，造成肝脏、肾脏和甲状腺衰竭［6］，雌鼠怀孕期间暴露DEHP会引起孕期缩短，并造成胎鼠的性别异常［7］。AEs类物质也具有潜在毒性，如己二酸二（2-乙基己基）酯（DEHA）属于三类致癌物，在体内长期积累会导致畸形、癌变和致突变。动物实验显示，高剂量DEHA能引起老鼠产生肝脏肿瘤，影响胎鼠发育［8］；对胎体发育有一定影响，可造成出生Wistar仔鼠体重明显下降，当DEHA达到一定剂量后，可使小鼠致死［9］。另外，PAEs和AEs的综合毒性也不容忽视，Jarfelt等［10］研究表明，DEHA会调控DEHP对Wistar仔鼠的影响，且两者的综合作用会导致Wistar鼠产仔数下降，出生后死亡率升高。

基于PAEs和AEs的毒性和污染普遍性，本文总结了当前PAEs和AEs化合物的分析方法和检测手段，并综述了其在生物体中的污染情况及安全评价进展，以期对控制其应用，建立增塑剂在生物体中的残留量和相关标准提供参考。

1 PAEs和AEs的检测方法

1.1 生物样品的前处理方法

生物样品前处理是目前生物体分析的瓶颈，而且往往是测定误差的主要来源。常用的PAEs和AEs前处理方法有液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、液-液微萃取（liquid-phase micro-extraction，LPME）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、固相微萃取（solid-phase Microextraction，SPME）、索氏提取（Soxhlet extraction，SE）、超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SPE）、超声萃取（ultrasonic extraction）、微波辅助萃取（microwave assisted extraction，MAE）和加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）等［11］。

液-液萃取、液-液微萃取、固相萃取以及固相微萃取主要适用于水样和大气样品的检测，如朱莉萍等［12］采用中空纤维膜-液相微萃取结合GC-MS对蔬菜汁中15种邻苯二甲酸酯进行检测，并对萃取溶剂、振荡速度、振荡时间等条件进行了优化；童宝锋等［13］对比了C18固相萃取和液液萃取两种前处理方法测定水中的PAEs和AEs；张伟亚等［14］采用固相微萃取技术测定了塑料浸泡液中DEHA的含量，并考察了盐效应、萃取温度、萃取时间和热解吸时间对方法灵敏度的影响。而生物样品由于基质复杂，因而样品的提取方式和净化在测定PAEs和AEs的过程中非常关键，通常采用索氏提取、超声提取、微波萃取等方法初步富集分离后，再对提取液进行富集或净化后进行分析检测［15］。

索氏提取主要利用溶剂回流和虹吸原理，使溶剂反复萃取固体物质，从而使被提取物溶解于溶剂中，优点是设备花费低且易于操作，缺点是提取耗时长，提取过程需要消耗大量的溶剂，易对环境造成污染［16］。超声波提取是利用超声波的空化效应、热效应以及机械作用提取样品中的目标成分，样品适用范围广。微波萃取利用电磁场的作用使样品中的有机成分与基体有效的分离，具有热效率高、升温快速均匀，试剂用量少，节能污染小等特点［16，17］。陈丽旋等［18］对比了微波萃取、超声波萃取、索氏提取3种预处理方法对土壤或沉积物中PAEs的提取效果。结果表明，微波萃取、超声波萃取比索氏提取方法提取效率更高，所需溶剂更少。

传统的样品前处理通常需要大体积的溶剂，且消耗时间长，很难实现自动化。加速溶剂萃取法（ASE）利用升高温度和增加压力来提高物质溶解度和溶质扩散效率，其突出的优点是萃取效率高、萃取时间短、自动化程度高、有机溶剂用量少、对环境二次污染小等。现常用来取代索氏提取、超声提取、微波萃取等方法［19］。超临界流体萃取（SFE）是利用超临界条件下的流体作为萃取剂，从样品中取出待测组份的分离技术。ASE与SFE的萃取效率相近，原理相似。ASE使用常规的有机溶剂萃取，而SFE的萃取溶剂为液态CO2，对环境的影响小，可以说是一项比较理想的清洁的样品前理技术。邵海洋等［20］采用ASE法对沉积物中PAEs物质进行提取，建立了快速溶剂萃取／气相色谱-质谱联用（GC／MS）检测沉积物中16种PAEs物质的方法，该前处理方法处理简单，定性与定量分析准确可靠。任丽等［21］用吸附剂对黄河水中的有机污染物富集，比较超临界CO2萃取和溶剂洗脱水中的4种PAEs物质含量，并进行了GC-MS定性。结果表明，采用超临界CO2萃取PAEs的萃取效率比溶剂萃取效率略高。

近几年来国内外关于生物体中PAEs和AEs类化合物的前处理技术的报道较多。相对而言，超声、微波及索氏提取等方法虽然都能检测到PAEs和AEs含量，但是整个前处理过程耗费大量有机溶剂，且费时费力，计量准确度不高，检测限达不到要求。而超临界流体萃取、加速溶剂萃取等样品前处理技术少用或不用有机溶剂，对环境友好，且萃取效率高，分析结果准确度和精密度高，已逐步应用于生物样品中痕量PAEs和AEs的提取。

1.2 PAEs和AEs的测定方法

1.2.1 色谱法 近年来，国内外对PAEs和AEs的分析方法报道逐渐增多，并且随着现代仪器和分析手段的发展，气相色谱法、液相色谱法、荧光光谱法、红外光谱法、核磁共振法、薄层色谱法以及毛细管电泳法等已被广泛地用来检测分析水、大气、土壤及食品等固体样品中PAEs和AEs［15，16］。尤其是色谱-质谱联用技术，由于其具有分离效率高、灵敏度高、用样量少，同时通过离子监测模式可以确定化合物的分子量分子式甚至官能团，实现有效的定性定量等优点在PAEs和AEs检测中得到广泛的应用。如刘俊等［22］采用气相色谱-质谱法同时测定食品包装材料中14种PAEs和5种AEs类增塑剂，在优化的实验条件下，19种目标物的平均回收率达到85%～108%，相对标准偏差（RSD）为0.16%～2.7%。郭春海等［23］则利用气相色谱-质谱联用技术分析PVC包装材料中46种增塑剂，各组分检出限均在0.005～0.05mg／kg之间。Ezerskis等［24］也利用气相色谱-质谱分析比较了不同PVC食品包装材料中AEs的含量，实现了有效的定性定量。

1.2.2 免疫分析法 虽然气相色谱、高效液相色谱和气相色谱-质谱联用等技术能快速分析生物样品中的PAEs和AEs，但这些分析方法对仪器条件要求高，前处理的操作过程相对复杂、耗时。近年来，随着生物技术的发展，免疫分析尤其是酶联免疫吸附分析（ELISA）由于不需要昂贵的仪器设备，且特异性强、灵敏度高、操作简便快捷，在现场筛选和大量样本的快速检测中显示出独特的优势。张明翠［25］通过合成5种PAEs半抗原衍生物与载体蛋白BSA偶联形成全抗原和抗体，并采用荧光免疫技术和免疫实验，建立了快速测定PAEs类环境激素的固相抗原竞争荧光免疫分析方法，可应用于水样和塑料溶出液的测定。李乐［26］运用混合酸酐法将邻苯二甲酸单丁酯（MBP）与载体蛋白BSA分别以不同的偶联比率进行连接，制备成三种偶联比率的免疫抗原对小鼠进行免疫，确定了最佳偶联比，并建立了MBP的ELISA检测方法，其检测范围为0.8～1 000 ng／mL，最低检测限为0.8ng／mL，这为今后制备检测MBP的酶联免疫试剂盒和胶体金的研制奠定了一定的基础。魏晨曦［27］建立了两种基于邻苯二甲酸二丁酯（DBP）单抗的ELISA检测方法，采用人工抗原包被间接竞争ELISA和半抗原包被间接竞争ELISA检测方法，检测的线性范围分别是11.56～863.72μg／L和2.16～155.92μg／L；最低检测限分别为（9.21±1.28）μg／L和（0.93±0.20）μg／L，并对水样进行的DBP添加回收试验，回收率都接近100%，检测灵敏度和准确性可以满足水环境中DBP的残留检测要求。

1.2.3 PCR法 利用具有高灵敏度的聚合酶链式反应（PCR）检测技术检测PAEs也逐渐受到关注。白舟等［28］从鱼肝脏中提取含雌激素受体的细胞溶质，与不同浓度的PAEs结合，采用常规PCR方法扩增制备双链结合DNA，将其与配体-受体复合物反应的结合物，用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶处理，消解游离DNA，并以消解后产物作为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，该方法应用于水样中PAEs的检测，最低检测限达到10～100μg／mL。

2 PAEs和AEs的污染及安全评价研究

2.1 水体环境污染

由于PAEs和AEs是中等极性化合物，因而在水中的溶解性小，进入水环境的PAEs和AEs主要在水体中发生相应的吸附、富集以及迁移转化等一系列反应［29］。作为一种典型的疏水性化合物，PAEs和AEs与沉积物的相互作用是其突出的特点，调查发现水体中的PAEs不断向底泥中迁移［30，31］。Srivastava 等［32］对印度Gomti河中30个不同位置的沉积物样品中的PAEs进行了调查，发现DMP、DEP、DBP、DEHP和DOP这些物质含量较高，分别为10.54μg／kg、4.57μg／kg、10.41μg／kg、31.61μg／kg和5.16μg／kg，其中DEHP的检出率最高。

2.2 水生生物污染

我国海洋水体资源丰富，水生生物中如养殖淡水鱼、蛳螺等生活环境基本固定，当水环境受到污染后，在滤食饵料等过程中不可避免地从水、底泥中吸入PAEs和AEs。虽然PAEs和AEs在水环境中的初始浓度不是很高，并不足以构成对人和生物的直接危害，但是通过食物链的逐级传递和生物放大效应，可使这些环境中痕量的物质，在高营养级生物体内的含量提高几十倍甚至成千上万倍，因而可能对人和高等生物造成危害。王兆梅等［33］测得广东省主要养殖基地的罗非鱼体内PAEs污染物主要有DMP、DEHP、DBP和DEP，其中DBP含量高达38mg／kg，其余三种PAEs含量在16～25mg／kg之间。Glam 等［34］对墨西哥湾鱼体中PAEs进行了测定，DEHP含量为5μg／g。Aranda等［35］的研究表明，动物对PAEs有一定富集作用，某些鱼类的生物富集因子高达102～104。张蕴晖等［36］发现PAEs的含量呈现出水体＜土壤＜底泥＜水生生物的趋势，不同水生物对PAEs的生物富集程度不同，泥螺和虾较易富集DEP和DBP，而鱼类和河蚌较易富集DEHP。对养殖池塘中3种淡水鱼类（草鱼、鲫鱼和罗非鱼）体内6种PAEs含量的测定结果表明，这些鱼类均受到DEHP、DBP和DOP的污染［37］。在模拟受控条件下，4种PAEs化合物在龙须菜-篮子鱼食物链中存在积累放大现象，表现为：DEHP＞DBP＞DEP＞ DMP［38］；在30d的食物暴露条件下，总含量分别为1.72mg／kg、3.11 mg／kg、0.41mg／kg和0.08mg／kg，在鱼体不同组织中富集程度不一，DEHP和DBP在内脏组织中有较高的积累和分布，其次为鱼残体组织，肌肉组织中含量最低［39］。

2.3 安全评价研究

PAEs和AEs在全球塑料制品中广泛存在，并在生物体中存在累积效应等，因此很多国家和组织纷纷出台相应的标准和法规，明确规定塑料包装材料中PAEs和AEs的最大使用量和迁移限量，以降低增塑剂对生物体所造成的危害。如日本于2002和2003年发布通报，规定PVC医疗器械中禁止使用 DEHP［40］；欧盟2005／84／EC标准中规定在所有儿童玩具PVC材料中禁止使用邻苯二甲酸二己酯，邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸苯基丁酯，且在2002／72／EC中规定包装材料中DEHA向食品中的迁移量必须小于18mg／kg；韩国在2005年6月规定，PVC食品包装材料中禁止使用DEHA［41］。我国也已出台的相应的卫生标准要求地表水、食品PVC包装材料中禁止使用邻苯二甲酸酯和DEHA，但对生物体中PAEs和AEs的限量标准并未涉及。因此，如何有效地降解塑料中的增塑剂以及采用无毒增塑剂，如柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三丁酯（ATBC）来代替PAEs和AEs以保障生物体的安全性是今后增塑剂研究的热点。

3 展望

由于生物基质的复杂性，样品前处理过程仍然是分析PAEs和AEs的“瓶颈”步骤。因此，开发操作简便、快速、无污染的前处理技术和在线检测将是分析和检测PAEs和AEs的一个趋势。而且，目前生物体中关于PAEs的检测较多，而AEs的分析涉及还很少，因此有必要开展多组分同时分析，可以大大降低检验投入。另外，PAEs和AEs在生物体中累积的影响尤其值得关注，研究揭示PAEs和AEs向生物体迁移的规律，阐明其在生物体中的富集机制，建立增塑剂在生物体内的残留量及相关卫生标准，是未来研究的重要方向。

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