桑葚多糖对小鼠抗疲劳作用及其机制研究

刘 兵

(河南农业大学体育学院，河南 郑州 450002)

疲劳是指由于身体与精神状态的下降而导致的周身疲软、困乏与精疲力竭之感，是机体复杂的生理生化的综合反应，可导致机体神经、内分泌、免疫诸系统调节失常[1].运动性疲劳(Exercise-induced fatigue)被看做运动训练中人体的一种保护性反应机制，是一种生理性疲劳，有别于病理性疲劳[2].运动性疲劳已经成为大学生、健身人群和运动员中普遍存在的现象，对其生物学机制的研究已经成为各国运动生理工作者不懈努力的课题.开发安全、有效、无毒副作用抗疲劳食品对于缓解人们生活压力，促进大众健身效果和提高运动员的竞技运动水平具有重要意义[3].桑葚为多年生桑科桑树(MorusalbaL.)的成熟果穗.桑葚营养丰富，富含氨基酸、维生素、矿物质、黄酮、糖类及生物碱等多种生物活性成分，有“民间圣果”之称[4].桑葚具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖血脂、抗菌抗病毒和抗辐射等生物活性[5].有研究认为其主要活性成分为桑葚多糖(Mulberry amylose，MA)，桑葚多糖具有抗氧化作用和降糖作用[6].综合国内外研究发现，对桑葚的研究主要是在产品开发工艺、抗氧化能力和提高机体免疫力方面，关于桑葚重要功能成分桑葚多糖的抗疲劳作用评价甚少.桑葚作为被卫生部正式推出的“药食同源”作物，研究其抗疲劳作用对于优化大众饮食结构和提高身体健康有重要意义.本研究按照国际通用的抗疲劳研究方法，研究不同糖浓度的桑葚多糖对游泳小鼠的耐力运动时间和运动后血尿氮、乳酸、肝糖原等抗疲劳相关生化指标，旨在为桑葚抗疲劳功能食品研发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1试验材料

桑葚购于郑州市丹尼斯超市.150只雄性昆明种小鼠(许可证号：SCXK 2012-005)购于郑州大学试验动物饲养中心， 6～8 周龄，体重18～22 g.

1.2桑葚多糖的制备和试验动物的饲喂

1.2.1 桑葚多糖的制备 在参考已有其它种类多糖提取方法的基础上，采用水浸醇析法提取桑葚多糖[4].将100 g新鲜桑葚，剪掉果梗，于60 ℃烘箱进行干燥，粉碎，用150 mL的石油醚回流抽提脱脂，抽滤后凉干.加入150 mL体积分数为75%的乙醇浸泡过夜，除去黄酮、色素、单糖等，至乙醇提取液接近无色时取出，抽滤回收桑葚渣，凉干.凉干后的桑葚渣以料液比1∶25 加入250 mL重蒸水，置于水浴锅中，恒温80 ℃，间歇搅拌，提取4 h.将所得水提液抽滤去除杂质，减压浓缩至原体积的1/3时，加入250 mL体积分数为95%的乙醇，充分搅拌后放入冰箱静置过夜沉淀.然后冷冻离心(10 min，12 000 r·min-1)，收集沉淀.如此反复数次，直到乙醇接近无色，将沉淀凉干，得到桑葚多糖和蛋白质的混合物.混合物用少量蒸馏水溶解，加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇=1∶4)，充分振荡20 min，静置，分离，直到没有乳白色凝胶状蛋白质析出为止，收集上清液，60 ℃烘干，得到桑葚多糖.以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定MA含量[7].测得粗多糖质量分数为63.7%.将桑葚多糖精确配制成系列浓度的溶液备用.

1.2.2 试验动物及其分组与饲喂 适应性喂养3 d后，根据体重将小鼠随机分为5 组，每组30 只，即正常对照组(NC)、阳性对照组(PC)、低剂量组(LD)、中剂量组(MD)和高剂量组(HD).低剂量组、中剂量组和高剂量组每只小鼠每天灌胃摄入桑葚多糖的剂量依次为：100，300，900 mg·kg-1·d-1.正常对照组小鼠每次每只灌胃0.2 mL生理盐水，阳性对照组小鼠每次每只灌胃0.2 mL西地那非(Sildenafil)溶液.试验动物自由采食饮水，饲喂30 d.

1.3动物试验指标测试及方法

1.3.1 力竭游泳时间的测定 力竭游泳时间的测定按照参考文献[8]的方法.连续经口给予受试物30 d，小鼠末次给药30 min后，每只鼠尾根部负小鼠体重5%的铅皮，放入水温为28 ℃、水深40 cm的游泳箱中.用加热棒把水温控制在28 ℃，并将室温恒定在25 ℃.用秒表记录每只小鼠自游泳开始至力竭游泳时间(头部沉水底10 s为止)，该时间为小鼠的力竭游泳时间.

1.3.2 血清尿素氮含量的测定 参考文献[8]的方法进行.连续经口给予受试物30 d，于末次给药30 min后将小鼠放入水温30 ℃、水深30 cm的游泳箱中，每箱1次放入5 只小鼠，不负重游泳90 min.运动后休息60 min，将眼睛周围擦干净，拔眼球取血约0.5 mL，分离血清，用尿素氮试剂盒(购于南京建成生物技术研究所)进行测定.

1.3.3 血乳酸含量的测定 连续经口给予受试30 d，于末次给样30 min后，将小鼠置于水温为30 ℃的游泳箱中不负重游泳90 min，每次入水前均将水温调至30 ℃，室温恒定在25 ℃.游泳后拔眼球取血，分离血清，用乳酸试剂盒(购于南京建成生物技术研究所)进行测定.

1.3.4 肝糖原的测定 连续经口给予受试30 d，于末次给样30 min后，将小鼠置于水温为30 ℃的游泳箱中不负重游泳90 min，每次入水前均将水温调至30 ℃，室温恒定在25 ℃.游泳后立即处死取肝脏，经冰冻生理盐水漂洗后用滤纸吸干，用肝糖原试剂盒(购于南京建成生物技术研究所)进行测定.

1.4数据处理

采用DPS统计软件进行数据的处理，以平均值 ± 标准差表示，组间显著性比较采用组间t检验，在0.05和0.01水平上进行统计.

2 结果与分析

2.1桑葚多糖对小鼠体重增长的影响

饲喂30 d后，小鼠体重和体重的增加量各组之间比较均无显著性差异(表1).

2.2桑葚多糖对小鼠力竭游泳时间的影响

与正常对照组相比，各组小鼠的力竭游泳时间均有提高(表2).其中，中剂量组的差异达到显著水平(P<0.05)，阳性对照组、高剂量组的差异均达到极显著水平(P<0.01)；与阳性对照组相比，低剂量和中剂量组小鼠力竭游泳时间均极显著降低(P<0.01)，高剂量组不具有显著性差异.表明西地那非和桑葚多糖具有延长游泳时间的作用，随着桑葚多糖剂量的增加，具有明显的量效关系；并且达到高剂量时，其效果和西地那非相媲美.

表1 桑葚多糖对小鼠体重的影响

2.3桑葚多糖对小鼠肝糖原含量的影响

LD、MD和HD组小鼠的肝糖原含量随着摄入桑葚多糖剂量的增加而升高，PC组小鼠运动后即刻的肝糖原含量也极显著高于NC组(表2).与NC组小鼠相比，运动后MD组小鼠肝糖原含量即刻显著提高(P<0.05)；HD组小鼠的肝糖原含量极显著提高(P<0.01).与PC组小鼠相比，MD组小鼠的肝糖原含量显著提高(P<0.05)，但LD组和MD组小鼠均显著低于PC组(P<0.05).表明西地那非和桑葚多糖具有增加运动小鼠体内肝糖原的作用，且随着剂量的增加，效果越好，高剂量桑葚多糖的摄入优于西地那非的作用.

表2 桑葚多糖对小鼠力竭游泳时间、肝糖原含量、血清尿素氮和血乳酸含量的影响

2.4桑葚多糖对小鼠血清尿素氮和血乳酸含量的影响

运动后即刻PC、LD、MD和HD组小鼠的血清尿素氮和血乳酸含量均有降低.与NC组小鼠相比，PC组、HD组小鼠的血清尿素氮与血乳酸含量极显著降低(P<0.01)，MD组小鼠的血清尿素氮与血乳酸含量显著降低(P<0.05)，LD组小鼠的血清尿素氮与血乳酸含量有降低，但差异不显著.与PC组小鼠相比，NC组、LD组小鼠的血清尿素氮与血乳酸含量均极显著提高(P<0.01)，MD组小鼠的血乳酸含量显著提高(P<0.05)，HD组小鼠的血清尿素氮与血乳酸含量均差异不显著.表明西地那非和桑葚多糖均具有降低运动后小鼠体内血清尿素氮和血乳酸含量的作用，桑葚多糖高剂量的效果最好，基本与西地那非效果相一致.

3 结论与讨论

疲劳是一个涉及许多生理生化因素的综合性生理过程，是机体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常生理现象，它既标志着机体原有工作能力的暂时下降，又可能是机体处于伤病状态的一个先兆[9].合理营养是缓解运动疲劳的重要手段之一，特别是补充能量物质、抗氧化剂与一些运动代谢中间介质对于延缓疲劳的产生或者加速疲劳的消除具有重要的作用[10].桑葚多糖作为天然的植物多糖提取物，可添加于饮料、果汁、果酱中[11]，方便人们摄入，对其抗疲劳作用的评价不仅有利于桑葚资源的开发利用，更为体育事业的发展起到很好的推动作用.

本研究发现桑葚多糖的摄入对小鼠的体重没有影响，与西地那非和正常饮食小鼠相比，体重一直正常，表明在本研究采用的剂量范围内，桑葚多糖的摄入不会具有发胖或急剧降低体重的作用.力竭游泳时间是运动耐力的最直接体现，更是抗疲劳能力加强的宏观表现，对评价运动能力具有重要意义[12].从力竭游泳试验可以发现，桑葚多糖具有很好的提高小鼠的游泳耐力的作用，并呈明显的量效关系，特别是高剂量组小鼠的力竭游泳时间比正常组小鼠提高了将近2倍，其效果与现在常用的西地那非效果一致，表明桑葚多糖具有提高运动员耐力和抗疲劳能力的作用.

疲劳产生常伴有血糖浓度的降低，能量物质的耗竭被认为是产生疲劳的重要原因之一[8].肝脏和肌肉是机体能量代谢的重要场所，肌、肝糖原储量和血糖水平直接影响着机体耐运动性疲劳的能力.长时间、大强度运动会导致肌糖元的快速消耗，促使血糖向肌糖元转化；为维持血糖平衡，大量的肝糖原被分解转化为血糖[13].因此，更多的肝糖原和肌糖原储备量，意味着运动时可以为肌纤维收缩提供更多能量，从而延缓运动性疲劳的产生[14].本研究发现，摄入不同剂量的桑葚多糖均能够提高小鼠机体糖原的储备量，特别是高剂量组不仅极显著的提高了肝糖原储备量(P<0.01)，而且与阳性对照相比，其效果还要优于西地那非.本研究还发现，不同组间的肝糖原变化趋势和力竭游泳时间变化趋势具有一致性，进一步提示桑葚多糖提高肝糖原储备是其提高机体耐力和抗疲劳作用的原因之一.

血尿素氮是蛋白质的代谢产物，在大强度、长时间运动时机体不能通过糖、脂肪分解代谢获得足够的能量，骨骼肌中蛋白质与氨基酸参与分解代谢供能，产生尿素氮.血清尿素氮是评价机体对运动疲劳的一个重要指标，机体对运动应激的适应能力越差，血清尿素氮增加越明显，疲劳发生的越快[15].乳酸是体内糖无氧代谢的终产物，肌糖原大量消耗并产生大量乳酸，肌肉和血液中乳酸的逐渐堆积会直接或间接引起肌肉运动能力下降，造成运动性疲劳[16]；乳酸堆积可以降低肌肉和血液的pH值，对神经肌肉接点处的兴奋传递起阻碍作用，抑制磷酸果糖激酶的活性，延缓或中断无氧糖酵解的反应过程，使ATP合成速度变缓[17]；血液中乳酸含量的降低被认为是抗疲劳的重要指标之一[18].本研究结果显示，连续给予小鼠不同剂量的桑葚多糖30 d,在大强度耐力训练后，中剂量组和高剂量组小鼠的血尿素氮水平与血乳酸含量均显著低于正常对照组(P<0.05)，说明桑葚多糖具有降低运动后小鼠体内的血清尿素氮水平，抑制运动后小鼠血清乳酸升高的作用.

本研究表明桑葚多糖具有明显的抗疲劳作用.与空白对照相比，高剂量桑葚多糖900 mg·kg-1·d-1能极显著延长小鼠的力竭游泳时间(P<0.01)，极显著增加运动后小鼠体内肝糖原的储备量(P<0.01)，极显著降低运动后小鼠体内的血清尿素氮和血乳酸含量(P<0.01).随着桑葚多糖摄入量的增加，小鼠的抗疲劳效果呈显著的量效关系，并且高剂量与西地那非效果相一致，表现出很好的抗疲劳功效.

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