海带渣菌肥作为土壤添加剂对土壤抑制病原真菌活性影响的研究

肖 伟, 闫培生

(哈尔滨工业大学海洋科学与技术学院，山东威海 264209)

土壤是微生物的大本营,特别是在一些耕作土壤中由于含有各种植物的有机残体及人工施入的大量有机堆肥，土壤中的有机质十分丰富，利于土壤中微生物的生长与繁殖。土壤中的微生物种类与数量虽然众多，但大多数都属于中性微生物，这些微生物对植物并没有明显的益处或者危害；对植物有益和有害的微生物只占土壤微生物的很小部分，但这小部分微生物却与植物病害特别是一些土传病害的发生与流行密切相关。自然界中广泛地存在抑菌型土壤(抑病型土壤)，一般认为病原菌不能在这些土壤中定殖，或者能定殖但危害很小或没有危害。抑菌型土壤一般可以分为普通抑菌土壤和特异抑菌土壤，普通抑菌土壤一般不具有转移性，但特异抑菌土壤具有转移性，可以通过一定的农业措施来进行培育[1-3]。

植物病害的生态防治是现代植物病害防治的发展趋势。从植物病害的生态防治角度讲， 植物病害的发生可以看成是植物所处的生态系统失衡所致，因此植物病害的生态防治就是生态系统平衡的重建，其防治观点在于将病原微生种群的数量与危害性控制在允许的阈值之内，从而确保植物生态系统的健康发展。可见植物病害的生态防治是一个综合系统的工程，其包括土壤微生态、作物栽培以及植物自身的抗病特性等方面的内容[4-5]。

有机微生物菌肥是一种新型的肥料，其作为土壤添加剂可以改善土壤结构，促进植物的生长，增强植物自身抗性与抗逆能力，提高农作物的品质与产量，所以在农业生产过程中使用有机微生物肥料已经成为了植物病害生态防治的重要措施之一[6-8]。但在有机微生物菌肥，特别是在有机堆肥的使用过程中，有机质本身对土壤微生物群落，尤其是对土壤中有益拮抗微生物群落的影响是一个特别值得关注的问题，即有机质本身是否对土壤中的微生物有一定的选择性促进作用；较有害菌群而言，其是否更能促进有益菌群的生长或者能选择性地促进所引入的有益微生物的生长[9]，即这些有机质的施用是否有利于特异型抑菌土壤的培育。有机微生物菌肥的施用对土壤微生物的影响研究，主要集中在对微生物区系特征进行研究，但由于土壤中的绝大多数微生物为中性微生物，所以对微生物区系特征的研究很难准确地反映土壤的抑菌能力，很难对土壤的抑菌能力进行宏观的量化。土壤中微生物的代谢产物要作用于植物，首先这些物质要溶于植物根际土壤的水中，因此土壤浸出液的抑菌活性能反映土壤本身的抑菌活性，所以测定土壤浸出液的抑菌活性，能从宏观上量化土壤的抑菌能力。通过Tip-culture定量检测法对土壤浸出液抑菌活性进行检测，可以容易地做到对土壤抑菌能力进行很好的宏观量化[10-11]。

海带渣是加工海带过程中主要固体废弃物。海带渣中的主要成分为海藻纤维、蛋白质、海藻多糖、壳聚糖、多酚、甜菜碱等。作为海带工业中最大宗的固体废弃物，海带渣传统的主要处理方式是采取卫生填埋，但这种方式不仅浪费土壤资源，更浪费了海带渣中本身未被利用的有机质成分，这不符合低碳发展的要求,所以围绕海带渣的资源化利用展开了广泛的研究[12-16]。试验以海带渣固体发酵微生物菌肥为研究对象，研究其作为土壤添加剂对土壤抑菌活性的影响，希望通过施用海带渣固体发酵微生物菌肥能在一定程度上对特异抑菌土壤进行培育，并希望以此作为植物病害生态防治的重要措施之一。

1 材料与方法

1.1 材料

海带渣购于山东某海带加工厂，制造生物肥采用的菌种为本实验室分离得到的一株枯草芽孢杆菌JGA2(-5)27-2，供试植物病原真菌为本实验室保存的一株寄生曲霉突变菌株，该突变菌株不能产生黄曲霉毒素，但能积累红色的黄曲霉毒素合成的中间代谢产物。

1.2 海带渣固体发酵微生物菌肥制备方法

生物菌母液制备：将试管斜面上的生防枯草芽孢杆菌JGA2(-5)27-2取一环接种到装有20 mL GY培养液(含20 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉)的三角瓶中在摇床上培养12 h (35℃、150 rpm)，备用。

海带渣固体发酵：将海带渣进行粉碎至0.5 mm，在培养瓶中装38 g干海带渣、 2 g蔗糖与60 mL去离子水，pH值为自然，灭菌。按照4%的接种量(4 mL)将制备好的生物菌母液接种到固体培养基中，在35℃进行固体发酵8 d。发酵后海带渣固体微生物菌肥中的有效活菌数为每克3.4×1010个。

1.3 试验设计

1.3.1 海带渣固体发酵微生物菌肥抑菌活性试验 试验采用室内培养方法。从农场中取耕作土壤，用花盆装土，每盆装土700 g。在土壤中分别加入发酵后的海带渣微生物菌肥10 g(F10)、 20 g(F20)、 40 g(F40)与未发酵的海带渣基质10 g (NF10)、 20 g(NF20)、 40 g(NF40)，以未添加海带渣固体发酵微生物菌肥与未发酵的海带渣基质的处理组为对照2(CK2)，共7个处理，每个处理重复两次。

在培养30、 60、 90 d后收集土壤浸出液。方法：晚上8点向各盆土壤中浇300 mL去离子水，过夜(12 h)。第二天早上8点收集托盘中的浸出液，将收集的浸出液进行离心与微孔滤膜过滤，备用。

1.3.2 花生盆栽试验 试验采用盆栽方法，供试作物为花生。从农场中取回耕作土壤700 g装于花盆中，设施用20 g海带渣固体发酵微生物菌肥与20 g未发酵的海带渣基质(60%含水量，未添加蔗糖)两个处理，以未添加海带渣固体发酵微生物菌肥与未发酵的海带渣基质的处理组为对照，每处理设3次重复。每个花盆中播5粒花生种；播种后70 d取土壤浸出液进行抑菌活性的Tip-culture测定(图1)。

2 结果与分析

2.1 海带渣固体发酵微生物菌肥对土壤抑菌活性的影响

试验通过Tip-culture的培养方法对土壤浸出液抑制病原真菌寄生曲霉活性进行定量检测，检测结果如表1。 试验结果表明, 施用海带渣菌肥能显著地提高土壤的抑菌活性，且在处理30 d后的测定值大于其他时期的测定值。这一现象的原因在于海带渣固体发酵微生物菌肥本身具有较大的抑菌活性，同时其活性能较长时间稳定地存在于土壤中。

在3次不同时间所取的样本中，处理F20与处理F40的抑制病原真菌的活性均高于同一时期的其他处理，两处理间差异不显著。30 d后，处理F20与CK2、 NF10差异显著，与CK1、 NF40差异极显著；处理F40与CK2差异显著，与CK1、 NF10、 NF40差异极显著。60 d后，处理F20与CK2、 F10、 NF10、 NF20差异显著，与CK1差异极显著；F40与NF10差异显著，与CK1差异极显著。90 d后，处理F20与CK2、 F10、 NF10差异显著，与CK1差异极显著；处理F40与处理NF20差异显著，与CK1、 CK2、 F10、 NF10差异极显著。试验表明， 施用20 g或者40 g海带渣菌肥均可有效抑制土壤病原真菌的活性。

表1 不同处理对土壤浸出液病原菌活性的抑制率(%)

2.2 花生盆栽验证试验

试验通过花生盆栽试验对施用海带渣固体发酵微生物菌肥对土壤抑菌活性的影响做进一步的验证(图1)。播种70 d后， 取土壤浸出液进行土壤抑制病原真菌寄生曲霉活性的Tip-culture测定，以此对海带渣微生物菌肥能否提高土壤抑制病原真菌活性进行进一步的验证。花生盆栽试验也为海带渣菌肥在农业生产中的推广应用奠定了一定的理论基础。Tip-culture培养结果如图2，其菌丝的生长量(3个重复的平均值)： 未添加海带渣菌肥和未发酵海带渣的处理的Tip管中的寄生曲霉的生长量为(0.0215±0.0008) g，施用海带渣菌肥处理的Tip管中的寄生曲霉的生长量为(0.0134±0.0009) g，施用未发酵海带渣处理的Tip管中寄生曲霉的生长量为(0.0185±0.0014) g。以未施用海带渣菌肥和未发酵海带渣的处理为对照，进行多重比较发现， 施用海带渣菌肥的处理能极显著地提高土壤抑制病原真菌的活性；施用海带渣菌肥的处理与施用未发酵海带渣基质的处理差异极显著。施用海带渣菌肥处理的土壤的抑菌活性比对照提高了37.67%，而施用海带渣处理组的土壤的抑菌活性比对照提高了13.95%。

图1 花生盆栽验证试验Fig.1 Peanut pot validation test

图2 花生盆栽验证试验土壤浸出液抑制病原真菌寄生曲霉活性的Tip-culture检测Fig.2 Determination of the inhibitory activity of soil leachate against pathogenic fungi Aspergillus parasiticus by using the tip-culture method

利用SPSS软件对试验数据进行统计分析，分析采用比较均值单因素ANOVA。统计分析结果表明， 对照与海带渣菌肥之间差异极显著(P=0.000)；对照与未发酵海带渣之间差异显著(P=0.015)；海带渣菌肥组与未发酵海带渣组之间的差异极显著(P=0.001)。花生盆栽验证试验表明， 在栽种了花生的条件下施用海带渣菌肥能极显著提高土壤抑制病原真菌的活性，此研究为海带渣菌肥在农业生产中的推广应用提供了一定的理论基础。

3 讨论

土壤中绝大多数的微生物都属于中性微生物，有益和有害微生物仅占较少一部分，但这小部分的有益和有害微生物却与植物病害的发生与流行密切相关，特别是植物的土传病害。向土壤中添加pH调节剂以及施用微生物菌肥或者有机堆肥是植物病害的生态防治的重要措施。施用石灰粉或者硫磺粉等来进行土壤pH值的调节，使土壤的pH值不利于某一病害的发生，而有利于某一植物的生长，在这种此消彼长的综合作用下提高植物的抗病性；施用微生物菌肥或者有机堆肥可以在一定程度上减少化肥的使用量，有利于调节土壤的理化性质，有利于恢复土壤中微生物的数量与达到土壤中微生态的平衡，利用拮抗微生物减少病原物群体数量，有利于促进植物的生长与提高植物的自身抗性。

本试验以海带渣固体发酵微生物菌肥为土壤添加剂来处理土壤，并希望通过此方法引入特定的生防拮抗细菌来进行特异抑菌土壤的培育。在研究过程中对土壤抑菌活性的量化往往缺少有效的手段，试验通过对土壤浸出液抑菌活性进行Tip-culture的定量检测，实现了土壤抑菌活性的量化。此手段简单易行，便于在研究中使用。本研究同时为植物病害生态防治中有效土壤添加剂(微生物菌肥或者有机基质)的筛选提供了简单易行的操作方法，并为海带渣的资源化利用提供了一定的理论基础。

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