原料乳细菌总数快速检测方法研究进展

孟宪梅，杨志国，孙肖明

（1.吉林工商学院，吉林长春130062；2.粮油食品深加工吉林省高校重点实验室，吉林长春130062；3.吉林市太太食品有限责任公司，吉林吉林132011）

原料乳细菌总数快速检测方法研究进展

孟宪梅1，2，杨志国3，孙肖明1，2

（1.吉林工商学院，吉林长春130062；2.粮油食品深加工吉林省高校重点实验室，吉林长春130062；3.吉林市太太食品有限责任公司，吉林吉林132011）

概述了原料乳细菌总数快速检测方法的研究现状及最新研究进展，对电导微生物技术、PCR技术、ATP生物发光技术、流式细胞技术、直接表面荧光过滤技术、酶联免疫法、生物传感器法、智能化图像识别技术进行了归纳，并对国内的研究方向进行了展望。

原料乳；细菌；快速检测

原料乳营养丰富，是细菌良好的培养基，在挤乳、收集、贮藏、运输的过程中极易污染细菌。目前我国乳品企业应用的细菌检测方法，主要有培养法和染色法两种，虽然具体操作程序有所不同，但是都存在着耗时、费力、操作繁琐等不足，影响着企业对原料乳品质的正确判别和生产。因此准确、快速、容易操作的细菌快速检测方法正在成为乳品企业关注的重点，直接决定着企业产品品质与综合竞争力的提升。本文综述了目前世界乳品领域内应用较为成熟的检测方法，并对各种方法进行对比，同时也对正在进行研究的最新检测手段进行介绍。

1 电导微生物技术

该技术的工作原理是基于微生物生长导致样品电导率的变化，其方便之处在于，只要样品本身是液态就可以直接注入培养瓶中不需要经过稀释。微生物在培养过程中，使得液态样品中的糖类发酵成乙酸、乳酸等，蛋白质变成氨基酸，由不导电的大分子变成导电小分子，从而改变培养瓶中液体的电导率。电导率从基线到明显增加的点，称为检测时间，检测时间长短与液态培养物中微生物总数多少关系密切，数量越多，检测时间越短，数量越少，检测时间就越长[1]。刘玲君等[2]应用英国的MALTHUS微生物快速分析仪，电热恒温培养箱等对100个污染度梯度不同的原料乳样品进行检测，同时用平皿计数法进行对照。结果表明方法可行，且具有测定结果更快捷、省力。由于资料收集自动进行，测试可以不间断，使原料奶得以更及时、更快的监测，具有传统平皿计数法测试所不能比拟的优点。但是当检测样品中含菌量少的样品时需要时间长（16 h～20 h），并且设备昂贵，难以普及是该种技术方法目前存在的缺点。

2 PCR技术

2.1 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点[4]。杨君[5]等采用收集离心后的细菌沉淀加入裂解液，煮沸裂解后获取细菌DNA，然后应用荧光定量PCR法扩增检测细菌总数，全程耗时仅1 h～2 h，与该试验进行对比的包括传统的国标平板培养计数法和3M培养法，结果显示，通过荧光定量PCR技术进行细菌总数的检测操作方便、灵敏、检出限低，虽然该方法与国标培养定量法所得实验数据存在差异，但是都在可接受的实验误差范围内，可应用在原料乳细菌总数的快速检测中。

2.2 多重PCR技术

多重PCR是指在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，然后针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术[6]。在污染食品的致病菌中常见的有沙门氏菌、单增李斯特菌、金葡菌等，主要通过食品、饮水感染人类，导致细菌性食物中毒。武卫影等[7]应用三重PCR技术将食品中常见的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌经6 h～8 h内快速检出，为3种食源性致病菌检测试剂盒的研发奠定了基础。BaiY（2013年）等[8]应用氨基修饰硅壳磁性纳米颗粒（ASMNPs）结合多重PCR（M-PCR）对人为污染肠炎沙门氏菌和李斯特的原料奶进行检验，其敏感程度已经达到15CFU/mLand 25CFU/mL。

3 ATP生物发光技术

ATP存在于包括细菌在内的一切活体细胞组织中，当荧光酶系统和ATP接触时就会发光，且光的强度与细菌的ATP含量成正比，这为快速检测样品中是否存在细菌提供了非常有利的依据[9-10]。田丽萍[11]曾用ATP生物发光技术与丹麦福斯的FOSS细菌总数测测定仪进行原料乳中细菌总数的检测比较，在25℃条件下，采用BLW 0401微量光度计，将细菌细胞通过裂解剂裂解从而释放其中的ATP，并应用荧光素酶进行检测，得到与细菌细胞数对应的发光值。从试验结果可知，ATP生物发光技术与FOSS细菌总数测定仪在检测原料乳细菌总数方面存在较高相关性（R2=0.905 3）。该技术能够在2min～5min内快速检出原料乳中的细菌总数，且成本低廉，值得推广。Sharpe等[12]也经过多次重复试验，证明了ATP生物发光技术在快速检测原料奶细菌总数方面确实可靠。李春艳[13]等将ATP生物发光法进行试验的结果是，乳中微生物总数与光值呈正的直线相关（r=0.948 5），相关程度为显著相关（P＜0.001），线性回归方程为：y=1.049 6x+2.4。同时与平皿培养法检测结果做比对，结果表明两种方法显著相关。

4 流式细胞技术

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术[14]。该技术无需对样品进行培养可直接检测样品中细菌的性质和数量，同时具有高度敏感和应用广泛以及节省时间等优点。主要原理是让带菌的样品流经流式细胞仪小孔，通过检测细菌细胞与周围介质的电传导率的差异；或选用激光为发光源将聚焦后的光束垂直照射到样品流上，分析光的散射情况；或用荧光物质标记细胞，检测荧光信号。光的散射代表着细胞体积的大小，荧光信号的强度则反映了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此来定性和定量地判别微生物[15]。该技术早在1997年由Zee H[16]曾经在UHT的加工过程中有过应用报道。Pettipher[17]等（2005年），使用FCM快速检测牛奶中污的细菌数量，并取得了较为理想的实验效果。但缺点是设备昂贵。现在应用最多的是产品有丹麦福斯公司研制的FOSS细菌总数测测定仪（BactoScan FC）。

5 直接表面荧光过滤技术

直接表面荧光过滤技术（Direct Epifluorescent Filter Technique DEFT）是一种直接测定样品中细菌总数的快速检测法，可用于检测样品中活菌数量，由英国科学家Pettipher[18]设计开发，最初的目的是为了检测牛奶样品。其工作原理为吖啶橙染料以单体形式与双股DNA结合，经荧光显微镜观察可见出绿色荧光；以多体形式与单股DNA结合，经荧光显微镜观察橙色或者橙黄色荧光，而单股DNA只存在于活细胞中，因此可通过光的颜色判定样品是否存在活菌，并且通过表面荧光显微镜对具有荧光的细菌进行计数。试验证明[19]，该种方法测得样品细菌总数与传统的国标平板培养计数结果相符，相关系数为0.81～0.91。

DEFT计数能在24 h内预测5℃和11℃下保存的巴氏杀菌乳的质量是否一致每个样品的检测时间约25min费用为1美元。缺点是由于荧光抗体能与食品中固有微生物发生非特异性反应因此在使用DEFT技术时有可能获得假阳性结果，荧光显微镜、图象分析仪等设备昂贵。

6 酶联免疫法

酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，把受检标本测定其中的抗体或抗原和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗体或抗原反应，加入底物显色后，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析[20]。鄢志刚等[21]用单抗直接ELISA、PCR法分别对海地区5个牛场原料奶，采146份样品进行沙门氏菌检测，并用国标方法进一步验证，结果显示，直接ELISA法检测15个阳性样品，131个阴性；PCR法和国标法检测出的结果都是12个阳性。最终发现直接ELISA法的敏感性达100%，特异性很高，与国标复合率超过90%。是对大量样品进行粗选较好的选择。杨爱萍等[22]用单抗酶联试剂盒与PCR法快速检测沙门氏菌，结果也证实了ELISA法检测灵敏度高，特异性强，并且假阳性率一般在2.5~3之间，且可在短时间内快速筛去大量阴性样品。

7 生物传感器法

生物传感器是小型、便携的分析装置，它是将具有分子识别功能的生物识别元件和信号放大转换元件紧密结合的分析装置[23]。其工作原理是将待测物质与某种生物活性物质发生反应所产生的信号，经由换能器转换成为电子信号，再将该信号经放大器放大输出，从而反应出待测物质的浓度信息[24]。卢智远等[25]应用色素还原试验法的原理，利用自制的电化学生物传感器，对细菌在氧化还原过程中生成的电子数进行计测，最终测定乳制品中的细菌总数，该方法快速有效且能确定总量。但是由于生物本身具有不稳定性，经由传感器放大后的可检测信号波动较大，所以在具体应用中容易出现检测结果的偏差。

8 智能化图像识别技术

该技术是完全本土化的，由中国农业机械化科学研究院研发的一种快速原料奶细菌总数检测系统。目前该技术还没有在国外应用于乳业的资料，是一种新的尝试。其过程为首先通过生物显微镜和数码图像装置获取原奶中细菌的数字化图像，然后交由计算机存储，再由专门的智能图像识别系统将图像特征提取，与数据库中原有的标准特征图像进行对比分析，最终检测出细菌总数，也可进一步判断细菌的类别[26]。智能化图像识别系统优点是其检测过程具有良好的直观性，是真正的直接检测。不过，在细菌显微图象的转换和计算机识别与计数环节，还需要开发专门的智能软件。将整个过程进一步简化、易于操作，结果更加可靠。

9 结束语

原料乳细菌总数的检测方法很多，包括传统检测方法和正在研究中的快速检测方法，每种方法都存在着自身的优缺点，人们在充满期待的同时，目前应用较多的还是传统的标准平板计数法。一种快速检测方法是否可以广泛推广，应该从一下几个标准去判断：人力，是指检测是否可以实现自动化，检测设备操作是否繁琐复杂；财力，是指检测设备的资金投入与每次检测所需费用，是否能够被乳品企业接受，成本核算是否合理；时间，是指每次检测从样品处理到分析结果最终确定消耗的时间，是否能够达到在线检测标准；可靠程度，是指最终结果的准确度是否符合该样品相关指标检测要求。从目前发表的各种研究报告可以发现，世界发达国家从20世纪60-70年代就已经在实际生产中开始应用快速检测技术，而我国由于乳用动物的养殖比较滞后，除了沿用传统的方法进行细菌检测，多数企业还是依靠从国外进口设备和仪器来实现快速检测。因此加快快速检测的研究步伐，达到世界先进水平是当下国内科研工作者的当务之急。

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Research Progress on Rapid Detection of Total Quantity of Bacteria in Raw M ilk

MENGXian-mei1，2，YANG Zhi-guo3，SUNXiao-ming1，2

（1.Jilin Business and Technology College，changchun 130062，Jilin，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processiong of Jinlin Province，changchun 130062，Jilin，China；3.Mrs Food limited liability company of Jilin City，Jilin 132011，Jilin，China）

The current research status and the latest research progress on rapid detection of total quantity of bacteria in Raw Milk were reviewed.The methods of rapid detection for total quantity of bacteria included conductancemicrobiology technique，PCR，ATP bioluminescence technique，flow cytometry，directepifluorescent fiIter technique，enzyme-linked immunosorbentassay、biosensormethod，intelligentimage recognition technique．Finally，thedomestic developmentdirectionofcorrelated researchworkwasalsoprospected.

rawmilk；bacteria；rapid detection

蒋伟.流式细胞术测定汉滩病毒滴度方法的建立[D].第四军医大学,2011.

10.7666/d.d220428

2014-06-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.038

吉林省科技发展计划项目（201205054）；粮油食品深加工吉林省高校重点实验室开放资金项目（2014001）

孟宪梅（1964—），女（汉），教授，硕士生导师，博士，研究方向：食品安全及食品生物技术。