半薄切片技术实践探讨

胡基华，李 晶，2，张淑梅，2，孟力强，2，曹 旭，2

(1．黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150020;2．黑龙江省科学院高技术研究所，哈尔滨150010)

随着透射电子显微镜在科学研究中的广泛应用，已经成为观察组织细胞超微结构的一种手段，生物标本的制备，也是下一步结构观察和获得好结果的前提。但是，由于切片太小，有时难于观察到目标结构，为此需大量制备样品，造成工作量大而且消耗多。为使超薄切片能精确地切到目标部位，在做超薄切片前，首先要先做半薄切片来进行定位［1］。半薄切片(厚度0．6 ～0．8μm)的制备是一种常用制样手段，已经应用在胚胎学、病理学及动植物细胞学研究中。

半薄切片的制备在取材、固定、漂洗脱水、渗透包埋、切片和染色的每一个步骤，都很关键，任何环节的疏忽都会导致制片的失败。目前多采用环氧树脂和塑料包埋介质，由于后者对组织和细胞结构的保存较差，难以达到电镜观察的要求。同一样本若要作电镜观察又须进行光镜检查，环氧树脂包埋组织的方法能达到上述目的［2］。

1 固定液的选择和半薄切片的制备

固定液一般选择FAA固定液和卡诺固定液。FAA固定液(福尔马林5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)一般适用固定植物根、茎、叶、花药和子房组织。值得注意的是幼嫩材料应选用50%的酒精代替70%酒精，防止材料收缩;在固定液中加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬;卡诺固定液(纯酒精15 mL，冰醋酸5 mL或者纯酒精30 mL，氯仿5 mL，冰醋酸1 mL)，渗透迅速，但是固定时间不能太久，一般不超过1d。伊丽米努尔等使用不同浓度梯度的乙醇为胡杨种子脱水的实验表明，胡杨种子在4℃的70%酒精中可放置较长的时间，固定较快，对胡杨种子细胞内各种结构及其内含物有较好的固定作用［3］。

半薄切片的制备，可直接在超薄切片机上进行，也可以在半薄切片机上进行，切片时要注意刀口是否锋利，实验表明钝的刀口切出的片子易发生皱并且在光镜下有切痕，影响观察效果［4］。

2 脱树脂、脂碱

半薄切片常规染色方法有甲苯胺兰染色法、天青/美兰染色法、碱性复红法、苏木素—伊红法、H，E染色法和Giemsa染色法等。无论哪种方法都需要预先做好脱树脂处理，否则染料不宜渗入，影响染色效果。脱树脂使用的是NaOH的乙醇饱和溶液，脱树脂成功的标志是切片中组织周围的树脂已脱落，组织上颜色变淡，平展附着于载玻片上，无发皱、起卷现象，脱树脂过程中，可以随时夹出切片在光线下观察效果。脱的不够片子染色较淡，脱的太快，半薄切片容易从载玻片上脱落。载玻片黏附性可以避免掉片，是操作过程中不可忽视的环节，正确配制脱树脂试剂才能达到良好的去除树脂效果。而另一个避免脱片的关键是掌握好脱树脂的时间，这些将有助于树脂包埋样品用于光镜方面的观察与研究，使电镜样品不但可用于电镜方面的超微结构的研究，同时可进行光镜方面的研究。于红丽等用饱和氢氧化钠无水乙醇液与甲苯按3∶1混合液脱树脂，所需时间仅 5 min，树脂完全脱净［5］。

3 染色

选择理想的染色剂非常重要。一般细胞壁的染料有酸性品红、番红、固绿、甲苯胺蓝、苏木精、结晶紫、亮绿、苏丹Ⅳ等。细胞核染料(碱性)有碱性品红、苏木精、洋红、番红、地衣红和结晶紫等。细胞质染料(酸性)有酸性品红、甲苯胺蓝、曙红、固绿和苦味酸等。要遵循先用碱性染料再使用酸性染料的顺序，例如，对植物材料染色，使用番红—固绿对染法，木质化的细胞壁及细胞核呈红色，纤维素的细胞壁及细胞壁呈绿色;使用铁矾苏木精法，作为细胞一般结构及细胞分裂时期的优良染剂，可使用铁矾苏木精法，细胞分裂时期的染色体呈黑色。PAS(高碘酸—席夫)法染色，可将纤维素细胞壁及淀粉染成红色，植物组织会呈不同程度的红色［6］。

4 结语

随着电子显微镜技术的发展，在工业、农业、环境科学，尤其是在生物医学、计量医学、远程病理诊断等领域都得到广泛的应用。在整个电子显微镜技术中，切片制备的优劣直接反映在超薄切片上。影响切片质量的因素很多，在实际研究中，电镜标本制备是得到高质量超薄切片的工作难点，同时又是技术的关键。这就要求在实验中不断总结经验，根据不同的材料性质和观察目的，改良旧的方法，摸索新的方法，使这项技术日趋完善成熟。

［1］ 蒋海鹰，沈明，冯德云．环氧树脂包埋半薄切片脱树脂新方法［J］．湖南医科大学学报，2000，25(1):85—86．

［2］ 唐海兰，黄中新．环氧树脂包埋块半薄切片进行免疫组化染色的方法［J］．暨南大学学报 1997，18(4):9—12．

［3］ 伊丽米努尔，Kurt Zogauer，Bernd Cyffca，史军辉．改良半薄切片法观察胡杨种子结构［J］．西部林业科学，2013，42(2):26—30．

［4］ 杨兴龙，申洪．电镜样品半薄切片HE染色前脱树脂的技术处理［J］．黑龙江医药科学，2002，25(3):58—59．

［5］ 于红丽，张大红，徐夏红，等．电镜半薄切片制备方法的改进［J］．徐州医学院学报，2004，24(2):129—130．

［6］ 周馥，邢树平．介绍一种半薄切片定位样品的方法［J］．植物学通报，1999，17(3):274—275．