基因工程改造与中国仓鼠卵巢细胞凋亡

张存超，寇 庚，3，王 皓，3

（1.上海张江生物技术有限公司，上海201203；2.抗体药物与靶向治疗国家重点实验室，上海201203；3.第二军医大学肿瘤研究所，上海200433）

治疗性单克隆抗体是生物医药产业发展最迅速的领域，广阔的市场需求对其大规模生产提出了巨大的挑战。高效细胞株的高密度、长周期培养是提升抗体表达水平的重要手段，而长周期培养过程中，细胞凋亡是限制细胞密度提升和培养周期延长的关键因素［1］。细胞凋亡又称细胞的程序性死亡，它是细胞在多种因素诱导下的自杀行为。

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是表达单克隆抗体最常用的工程细胞，抑制CHO细胞凋亡的途径主要有细胞工程改造和培养基／培养条件优化［2］。抑制CHO细胞凋亡的细胞工程改造是在细胞中上调或下调一个或多个基因的表达，从而达到抑制细胞凋亡的目的。

作者在此主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及小分子RNA（microRNA）等方面综述了运用基因工程手段对CHO细胞凋亡改造的进展。

1 细胞凋亡信号途径与凋亡

依起始半胱天冬酶（caspase）的不同，细胞凋亡途径可分为外在途径、内在途径和内质网途径［3］。外在途径由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因子受体家族引发；内在途径由应激条件、化学治疗试剂和药物引发；内质网途径由内质网应激引起caspase－12的活化，从而导致凋亡。

参与细胞凋亡信号途径的基因分为两种：抑制凋亡基因与促进凋亡基因，抑凋亡基因的过表达或促凋亡基因的下调均可抑制细胞凋亡。

bcl家族基因与凋亡密切相关。丁酸钠能够提高重组蛋白的表达量，同时也会抑制细胞增殖并且诱导凋亡。未添加丁酸钠时，在CHO细胞中过表达bcl－2基因并不能抑制凋亡；然而，在添加5mmol·L－1丁酸钠后，bcl－2过表达通过降低caspase－3的活性而抑制凋亡，进而延长培养时间2d以上，并且使得人源化抗乙肝表面S抗原抗体的表达量提高了3倍［4］。

Han等［5］使用Tet－off系统通过100ng·mL－1强力霉素控制bcl－xL的表达，在310mOsm·kg－1和480mOsm·kg－1渗透压下，bcl－xL过表达在批次培养第8～10d通过降低剪切型caspase－7含量而抑制细胞凋亡。

Majors等［6］在CHO细胞中分别过表达了bcl家族基因mcl－1野生型基因及其不能被泛素蛋白酶降解的突变体mcl－1－5k，结果发现两者均能通过降低caspase－3活性而抑制细胞凋亡并分别提高VLA1抗体表达量40%和20%。

除了抑凋亡基因的过表达外，促凋亡基因的下调也能够抑制凋亡。caspase－3是一种常见的促凋亡基因，在CHO细胞中借助反义RNA下调caspase－3表达量显著抑制了5mmol·L－1丁酸钠诱导的细胞凋亡，然而其抗体表达量并未提高［7］。

2 细胞信号通路与凋亡

细胞信号转导是指信号分子经细胞内信号转导系统转换，最终影响细胞生物学功能的过程。细胞信号转导通过多种信号通路实现。PI3K／Akt／mTOR信号通路是细胞中与凋亡相关的重要通路。PI3K是细胞内的一种磷脂酰肌醇3激酶，当接受来自酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号后，PI3K被激活并使Akt从细胞质转移到细胞膜上；并在3－磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1的辅助下，通过使Akt蛋白磷酸化而激活，并最终激活Akt底物雷帕霉素靶体蛋白（mTOR）［8］。

Akt和mTOR是PI3K／Akt／mTOR信号通路的核心蛋白。研究显示，在CHO细胞中过表达人Akt可降低剪切型caspase－3蛋白含量，同时减轻染色体DNA片段化，这意味着Akt过表达抑制了CHO细胞凋亡［9］。与此类似，在CHO细胞中过表达人mTOR可提高培养基中血清缺乏（0.5%胎牛血清）或缺氧（1%氧浓度）时CHO细胞活率，并提高人胎盘碱性磷酸酶和α－淀粉酶的表达量3倍以上，表明mTOR可通过抑制凋亡提高细胞活率［10］。

3 小分子RNA（microRNA）与凋亡

microRNA是真核生物中广泛存在、长度为21～23个核苷酸、可调节其它基因表达的RNA分子。研究发现，microRNA可通过与RNA或其它分子作用抑制细胞凋亡［11］。

一些研究者通过靶向特定的microRNA显著抑制了细胞的凋亡。在CHO细胞中借助短发夹RNA（shRNA）稳定敲除mmu－miR－466h－5p，与对照相比，基因敲除后的细胞活率显著提高并延长培养时间35h以上，研究显示caspase－3和caspase－7的激活被延迟并促进了抑凋亡基因bcl 2l 2等的表达，而且此细胞的表达产物人胎盘碱性磷酸酶的表达量提高了43%［12］。microRNA－326通过降低丙酮酸激酶活性、上调caspase－3和caspase－7，促进人胶质瘤细胞的凋亡，通过特异性作用于microRNA－326或许可以抑制细胞凋亡［13］。除此之外，microRNA－133也是潜在的可用于抑制细胞凋亡的靶点［14］。

4 多基因协同作用与凋亡

在上述研究中，均是过表达单基因以抑制凋亡，此外，多基因常常被联合使用以进一步抑制凋亡。与单基因在CHO细胞中过表达相比，beclin－1和bcl－2在CHO细胞中共表达进一步降低了剪切型caspase－3和caspase－7的蛋白含量，并抑制了3mmol·L－1丁酸钠或0.1mol·L－1氯化钠诱导的凋亡［15］。与之类似，多基因的联合使用均取得了比单基因过表达更好的效果：如使用蜕皮激素诱导表达系统在CHO细胞中过表达抑凋亡基因E1B－19K和Aven显著抑制了CHO细胞的凋亡并提高单克隆抗体表达量40%以上［16］、bcl－2和酮戊二酸转运子过表达提高细胞对线粒体氧化损伤的耐受并抑制CHO细胞凋亡［17］、LDH－α敲除及bcl－2扩增通过作用于caspase－7来抑制二氢叶酸还原酶缺陷的CHO－DG44宿主细胞的凋亡［18］。与单基因过表达相比，热休克蛋白HSP 27和HSP 70在CHO细胞中过表达进一步抑制了细胞凋亡，并提高了干扰素γ的表达量54%以上［19］。在CHO细胞中共表达存活素和细胞周期蛋白D1在无血清培养基中抑制了33%～43%的早期凋亡［20］。

5 潜在抑制细胞凋亡的基因

细胞代谢可能也与凋亡相关。代谢副产物乳酸的累积抑制细胞生长甚至降低产物表达量［21］。由此推测，减少乳酸的产生或许可以抑制细胞凋亡。比如，过表达丙酮酸羧化酶或敲除LDH－α均可改善细胞中的糖酵解代谢并减少乳酸产生，这或许也可以抑制细胞凋亡。

苹果酸－天冬氨酸穿梭途径相关蛋白可能与凋亡相关。以Aralar1蛋白为例，Aralar1在胰岛β细胞中过表达可降低乳酸产生、改善线粒体能量代谢状态［22］，而乳酸是糖酵解的常见代谢副产物，可诱导细胞凋亡；线粒体膜电位的改变是凋亡早期的显著变化，由此推测Aralar1或许与凋亡相关。

此外，牛磺酸转运子在CHO细胞中过表达可提高细胞活率、减少乳酸产生并提高重组蛋白表达量，是另一个潜在的细胞工程靶点［23］。

从与凋亡相关的信号通路出发，对CHO细胞进行调控网络的基因工程改造可能带来更好的效果。除了上面提到的PI3K／Akt／mTOR通路外，Hippo－Mst信号通路或许可以作为潜在靶点。在果蝇中，hippo抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，被认为是抑癌基因。下调Hippo－Mst信号途径的关键蛋白表达可能加速细胞增殖并抑制细胞凋亡［24］。Akt通路的调控或许也能抑制细胞凋亡。PHLDA3是p53调节的Akt抑制基因，Akt的过表达抑制了细胞凋亡，以此推测PHL－

DA3的下调或许是抑制凋亡的另一个途径［25］。

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