行为学评价在针灸治疗神经精神疾病实验研究中的应用概况

徐世芬,尹平,吴君怡,曹燕

行为学评价在针灸治疗神经精神疾病实验研究中的应用概况

徐世芬,尹平,吴君怡,曹燕

(上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071)

行为学作为一门与生理学相关的新兴科学,近年来被广泛研究和应用,尤其在疾病的动物实验研究中。针灸治疗神经精神疾病的机制研究中,应用行为学评分是对针灸疗效的判定。该文就针灸治疗神经精神疾病的动物实验研究中应用行为学的情况进行归纳和总结,并指出所存在的问题和改进方法。

针灸疗法;行为学评定;实验研究;大鼠;小鼠

行为学评价被广泛应用于各种实验研究中,作为疗效评价的指标之一,尤其是神经精神疾病的机制研究中的重要组成部分。本文就近年来以大鼠或者小鼠为实验对象,通过使用针灸的干预方法来研究其对一系列行为学指标产生影响的文献进行综述,并给予初步的分析。

1 运动功能的评价

运动功能评分一般用于脑血管疾病、脑外伤和脊髓损伤等方面的的疗效评定。针灸的实验研究中,用于评定针灸干预中枢神经疾病的的疗效指标之一,观察大鼠或者小鼠的肌力和运动情况。

1.1 Zea Longa评分[1]

5分制评分,0分为无神经缺损症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走,意识丧失。

张闻东等[2]针刺对超早期脑缺血再灌注大鼠进行干预,并用Zea Longa评分方法对大鼠神经损伤行为评分进行评定,发现在缺血再灌注后12 h、24 h针刺组大鼠神经损伤行为评分与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.05),说明缺血再灌注后12 h、24 h针刺组大鼠神经损伤行为得到较为明显改善,针刺超早期脑缺血再灌注大鼠可促进其神经行为功能的恢复。模型组不做干预,电针组取百会、大椎、曲池、足三里穴给予电针治疗。崔宝娟[3]用电针干预局灶性早期脑缺血大鼠模型,分别于脑缺血后24 h,48 h及72 h用Zea Longa方法观察大鼠神经行为学变化,并测定缺血半暗带区凋亡因子半肤氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达,行为学结果与同时间点模型组比较,电针组均有显著性差异(＜0.05,＜0.01),电针组组内比较,72 h组与24 h组相比有显著性差异(＜0.01),表明电针刺激能有效改善脑缺血大鼠的神经功能,且有累积效应。

1.2 Bederson评分[4]

6级5分法,正常为5级(0分),表现为无神经功能缺损症状;4级(1分)为轻微缺损,表现为前肢蜷缩或屈曲,主要是持续性腕屈曲或肩内收伴肘部伸展;3级(2分)为中度缺损,表现为前肢持续性蜷缩或屈曲,可见腕、肘全部屈曲、肩部内收或内旋;2级(3分)为严重缺损,表现为持续性肢体蜷缩或者屈曲,一次肢体推力抵抗持续性减弱,自主活动时不伴肢体划圈行为;1级(4分)为非常严重缺损,表现为双侧肢体持续性蜷缩或屈曲,一侧肢体抵抗力持续性减弱,自主活动时出现肢体划圈行为;0级(5分),表现为无自发性活动,出现意识障碍。

周利等[5]采用头针治疗卒中易感性自发性高血压大鼠,应用Bederson评分评定大鼠神经功能缺损情况,结果1星期后,头针组与空白对照组相比,神经功能缺损程度有显著改善(＜0.05)。周爽等[6]对高血压性脑出血大鼠电针水沟、内关、足三里,观察其6 h、24 h、48 h和72 h的Bedserson评分,结果显示,电针治疗后神经症状明显改善,并随时间的推移逐渐趋于恢复,与模型组比较有显著性差异(＜0.01,＜0.05)。

1.3 Zausinger评分法[7]

Zausinger6分法,0分为不能自发行走;1分为自由走动状态下向病变对侧旋转;2分为抓住鼠尾,大鼠向病变对侧旋转;3分为病变对侧的侧压力抵抗力下降;4分为不能伸直病变对侧前爪,甚至全身向对侧屈曲;5分为无神经功能缺损。李雅洁等[8]进行了针刺水沟穴治疗脑梗死大鼠模型的参数优化研究,针刺治疗时间为栓线阻塞大脑中动脉后3 h及之后每隔12 h的共计6个时间点。于末次治疗后,进行大鼠Zausinger神经行为学评分以及软脑膜微循环和血流量测定,结果发现手针操作针刺水沟穴治疗脑梗死的最佳参数为针刺频率为3次/s,针刺时间为5 s。

1.4 Garcia评分法[9]

①自发活动(0～3分),在大鼠笼中观察5 min,观察其靠近笼壁及探究环境的能力;②提尾观察四肢运动的对称性(0～3分);③将大鼠置于桌子边缘,保持两后肢腾空,观察其两前肢运动的对称性(0～3分);④将大鼠置于笼壁上观察其攀爬能力,提尾拉下时感受其攀附力(1～3)分;⑤本体感觉(1～3)分,用钝棒触摸其两侧,观察其对刺激的反应;⑥触须反应(1～3分),从动物后面用钝棒触胡须观察其反应。评分范围在3～18分之间,18分者正常。

穆艳云等[10]用线栓法闭塞SD大鼠大脑中动脉,制作局灶性脑缺血再灌注模型。造模后2 h给予电针干预百会、大椎穴,进行Garcia行为学评定,结果电针组大鼠的神经行为学评分明显高于模型组(＜0.01),并且电针能提高海马神经元细胞线粒体离子泵ATP酶的活性,从而改善神经细胞的能量代谢。

1.5 Kikuo评分法[11]

Kikuo脑卒中指数评分法,根据所出现的一般精神状态、偏瘫等神经病学和行为障碍,制定出17分制评分法,症状越严重者,分数越高。

王援朝等[12]采用凝闭大脑中动脉皮层支的方法制作大鼠缺血性中风模型。造模成功后立即给予电针耳穴,取缘中和皮质下,留针20 min,每日2次,共4 d,并在术后24 h,48 h和72 h观察Kikuo行为学评分,结果耳针治疗后神经行为学评分在24 h和72 h均较模型组有显著降低(＜0.01)。1星期后的血液流变学检查提示,耳针治疗可以调节缺血区血液灌注量促进损伤脑细胞恢复。

1.6 Rivlin斜板实验[13]

倾斜板从水平位置起,每隔5°调整角度,板面附有带浅槽的橡皮垫,将动物朝左或朝右放置板上,角度从小到大渐增,以其能停留5 s而不跌落的最大角度来做评定,重复3次,取其平均值。该实验主要用于脊髓损伤后的动物后肢运动神经功能的评定。

李祖剑等[14]运用ALLEN’s致伤法制成大鼠T12中度脊髓损伤模型,给予电针治疗,应用斜板实验对不同组的大鼠在造模后12 h,治疗1星期和4星期后分别进行行为学评分。结果显示,在脊髓损伤后12 h和1星期,电针组与单纯针刺以及模型组在行为学无明显差异,而在4星期,电针组在斜板实验方面明显高于其他组别(均＜0.01)。因此,电针治疗能促进脊髓损伤大鼠后肢功能恢复,提高其行为学评分。

以上评分方法多应用于有肢体功能障碍的疾病评定,如脑血管疾病、脊髓损伤等。Zea Longa评分、Bederson评分、Zausinger评分、Garcia评分以及Kikuo评分均类似于临床上神经功能缺损评分方法。以上评分方法从简单到复杂,从粗略到精细逐渐递增。Rivlin斜板实验用于评定脊髓损伤,也比较简单。评分方法制定得越精细越能减少评定误差。因为评定方法均为人为操作,具有明显的主观性,要减少评定的主观性造成的误差,就应该多人评定以求平均值。但所查文献中未发现一篇报道提到评分是由3个以上评分员共同参与进行,以计算平均分数作为最终分数。也没有文献应用盲法,即评分者与操作者以及统计人员彼此分开,绝大多数研究都是先发现了行为学的变化后再进行断头取脑或者取血进行进一步的机制研究,以说明针刺对行为学改变的原理。准确、公正、精细的行为学判断是先决条件,因此其重要性可见。应用客观、灵敏性高,易操作的行为学评价方法进行针刺对神经功能损伤的实验研究是非常关键的。

2 自发行为的评价

自发行为的评价主要用于焦虑、抑郁等状态的评定。在大鼠的动物实验中应用最多的有Open-field(矿场)实验、糖水实验、强迫游泳和十字高架实验等。

2.1 矿场实验

Open-field test[15]是研究动物进入开阔环境后的各种行为,例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动,在中央区域活动较少,但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机,也可观察由此而产生的焦虑、抑郁心理。以往所用的测试工具是高40 cm,长、宽均为80 cm的立方体敞箱,底面用白线划分为面积相等的25块。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内,以动物穿越底面的格数(4爪均进入的方格方可记数)记录为水平运动次数,以后肢直立次数(两前爪腾空或攀附箱壁)记录为垂直运动次数。记录时间为3或5 min。如韩焱晶等[16]观察电针治疗慢性不可预见性轻度刺激结合孤养方法制成的抑郁大鼠模型的作用,用底部有25块格的面积相等的立方体敞箱来测定动物的活动情况。结果,电针治疗后的抑郁模型大鼠的运动次数和站立次数明显高于模型组,说明电针的治疗作用。

该方法主要应用于焦虑、抑郁情绪所致行为的评价,以及其他精神疾病的行为学评价,被广泛应用,目前还没有更好的评价方法可以替代。近些年来,Open- field视频测试系统的应用,为该法的测试提供了更加客观的数据。多采用红外线光束追踪法测定动物总运动情况。Xu S等[17]运用视频分析系统,测定抑郁大鼠的自发行为,运动速度、总运动路程和周边及中央活动时间与路程,站立次数等,不需要人工计数,完全电脑自动记录与分析数据,客观可靠。

2.2 糖水实验

糖水实验[18]是大鼠在禁水24 h后,同时给予1%蔗糖水和普通饮用水,24 h后测定两种水的消耗量,如果蔗糖水的消耗量明显减少,说明大鼠的糖水偏好降低,主要用于抑郁症模型大鼠的测定。如庄礼兴等[19]观察针刺与埋线不同方法治疗抑郁症大鼠的疗效差异,针刺和埋线百会、心俞、肝俞穴后,检测大鼠糖水消耗量,结果两种方法治疗后糖水消耗量明显增加,与模型组比较有显著差异,说明针刺和埋线均能改善抑郁状态。

糖水消耗试验的精确性不好把握,除非使用密封度以及精确度非常好的水瓶,不存在倾斜时滴水现象。否则误差比较大,很难得到确切数据。很多文献报道是断水24 h后只给蔗糖水,正确测量方法给两个水瓶,1个装有蔗糖水,1个装有普通水,分别测量两种水的消耗量。

2.3 强迫游泳

强迫游泳(forced swimming test)[20]是评价抑郁动物模型的经典测试方法,该实验方法是一种行为绝望实验法,其原理是当大鼠放进一个有限的空间使之游泳,开始时拼命游泳力图逃脱,很快就变成漂浮不动状态,仅露出鼻孔保持呼吸,四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去,实际是动物放弃逃脱的希望,属于行为绝望。经典的强迫游泳实验分两天进行。第一天让大鼠在25℃的深水中强迫游泳15 min,取出后烘干,归笼。第二天,在同样的条件下进行强迫游泳5 min,记录不动时间。不动时间越短,抗抑郁作用越强。目前该实验也多用于视频分析系统,数据记录客观准确。如Xu S等[16]观察电针百会、大椎对抑郁模型大鼠的效果中,应用强迫游泳测试视频分析系统,记录大鼠在25℃水中的漂浮不动时间,结果电针治疗后的不动时间较假针刺组以及模型组明显减少,说明电针有明显的抗抑郁作用。

强迫游泳试验的结果容易受很多因素的影响,如水温、水深、动物本身以及季节等。水温一般是要控制在25℃左右,水深的选择应以动物无法逃脱为标准。一般大鼠实验时水深为17～33 cm,小鼠实验时水深约10 cm。水太深,动物难以使用前爪和尾保持不动,就会游动和攀爬。水太浅,动物可利用尾和后爪保持平衡而影响实验结果。一般冬季和夏季的试验数据差距很大,冬季动物不愿动,而夏季非常活跃。所以如何很好地把握试验数据,排除各种影响因素都至关重要。

2.4 十字高架实验

高架十字[21]是国际上公认的测试动物焦虑行为的首要装置,主要测试动物的非条件性反射,它以动物自发性行为为基础,设计出两个开臂和两个闭臂的迷宫,并将迷宫抬高以提高动物进入开臂时的恐惧。该实验室利用动物对新异环境为探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理,形成动物的矛盾冲突来考察其焦虑状态。徐海洋等[22]电针百会、三阴交治疗慢性情绪应激焦虑模型大鼠,采用高架十字迷宫测试系统观察大鼠的行为,结果电针可以提高慢性情绪应激焦虑模型大鼠进入开臂的次数和在开臂停留时间的百分比,具有明显抗焦虑作用。

高架十字迷宫是一个简单、快速、结果重复性好的焦虑检测模式。为了提高大鼠入臂总次数,避免大鼠躲在闭臂,通常将大鼠置于开场中活动5 min后再放入迷宫。实验前5～7 d每天抚摸动物1～2 min也可减少无关应激刺激对本实验的影响。目前还没有更好的测定焦虑情绪行为的测试系统和方法。

3 学习记忆的评定

学习记忆功能评定一般包括Morris水迷宫、Y迷宫、跳台实验、避暗实验等,主要是评价大鼠的学习记忆能力。

3.1 Morris水迷宫

Morris水迷宫[23]是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段,其在痴呆研究中的应用非常普遍。较为经典的Morris水迷宫,测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验(place navigation)历时4 d,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)。空间探索试验(spatial probe)是在定位航行试验后去除平台,然后任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在一定时间内的游泳轨迹,考察大鼠对原平台的记忆。远慧茹等[24]观察针刺治疗多发性脑梗死痴呆大鼠的疗效,通过栓子注入法制作多发梗死性痴呆模型,随机分为模型组、针刺组和非穴位组,应用Morris水迷宫观测大鼠的空间记忆能力,结果针刺组大鼠在隐蔽平台实验、反向实验以及探索实验中的学习成绩均明显优于模型组和非穴组,说明针刺可明显改善多发性脑梗死痴呆大鼠的空间记忆能力。

3.2 Y迷宫

Y形迷宫(Y maze)即为三等分辐射式迷宫,由3个支臂和1个连接区组成,三臂相互夹角为120°,每臂末部铺以食物槽,用以盛放食物。各臂可依次分为起步区、错误臂以及正确臂。其顶端有一盏15 W的信号灯,底部有电击装置,训练大鼠按照信号灯跑向安全通道,一般将动物经训练而达到学会的标准定为连续10次测试中有9次正确者。记录每一动物迷路分辨学习达到学会标准所需的训练数,以此作为评价动物学习能力好坏的客观指标。Y迷宫主要用于优先选择和空间学习任务的检测。和Y型迷宫类似的还有T型迷宫,其实验的设计原理和实验方案和Y型迷宫都十分相似,只是把迷宫的形状由Y型换成T型。卢雨微等[25]探讨耳针对血管性痴呆大鼠学习记忆障碍的改善作用,用Y迷宫检测大鼠的学习记忆能力,结果耳针治疗后大鼠的电击次数明显较模型组减少,说明耳针能明显改善血管性痴呆大鼠的学习记忆成绩。

从理论上讲,Morris水迷宫实验是一个厌恶驱动的实验,而臂形迷宫实验是食欲驱动的实验。水迷宫与放射臂状迷宫相比较的主要优越性在于水迷宫中,动物训练所需的时间较短(1星期),而臂形迷宫则需要几星期的训练时间;Morris水迷宫空间宽阔,动物气味影响几乎不存在。因此,Morris水迷宫是目前世界公认的较为客观的学习记忆功能评价方法。

3.3 跳台实验

跳台实验的装置为1个25 cm×20 cm×75 cm的被动回避反应箱,箱底铺直径为1 mm铜栅,通36 V交流电,铜栅的一角固定1个8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动3 min,熟悉环境,然后接通铜栅电源,大鼠受到电击,其正常反应是跳回泡沫块以躲避伤害性刺激,多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区,如此训练5 min,并记录每只大鼠首次找到安全区所需的时间(反应时间)和5 min内受到的电击次数(错误次数),作为学习测试成绩。24 h后重复上述试验,记录每只大鼠第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和错误次数,作为记忆测试成绩。蒋希成等[26]观察针刺对老年痴呆大鼠的疗效,结果针刺组大鼠跳台潜伏期较模型组和治疗前明显延长,错误次数明显减少。说明针刺可明显提高AD大鼠的记忆能力。

学习记忆实验方法的基础是条件反射,跳台法就是其中的一种较常用的方法,该方法的优点是简便易行,既可观察对记忆过程的影响,也可观察对学习的影响,有较高的敏感性。

3.4 避暗实验

避暗实验又称为被动回避(passive avoidance),是利用小鼠或大鼠具有趋暗避明的习性设计的装置,一半是暗室,一半是明室,中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅。动物进入暗室即受到电击,大鼠受到电击后可自行逃出暗室,记录潜伏期及5 min内受到电击的次数。方程[27]研究电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆功能的影响,采用避暗实验来观察大鼠的行为变化。结果脑缺血1.5 h再灌注12 h,模型组大鼠避暗潜伏期缩短,错误次数明显增多,电针干预可以延长避暗潜伏期,减少错误次数,说明电针,特别是术前电针预处理可以改善缺血模型大鼠的学习记忆功能。

本实验也同样简单易行,操作简便,以潜伏期为指标,动物的差异性比较小。对记忆过程特别是记忆再现有较高的敏感度。

近些年来,自发行为和学习记忆能力的测试,大多采用视频分析系统,避免了人为因素的误差,增加了行为学测定的客观性和准确性,为进一步的机制研究奠定了基础。

4 评价与展望

针灸作为一种干预措施,治疗神经精神系统疾病,临床疗效确切,并被广泛应用。但其机制研究尚需要进一步深入进行。而行为学评定在基础研究中可以直观显示出针灸的治疗效果,已经被应用于针刺效应及机制研究中。行为学的评定在研究中起关键作用,如果评定不客观,数据误差较大,都直接影响了针刺机制的结果。在今后的实验研究中,应该尽量采用视频分析系统,以求最大化的客观性;具体操作应该根据权威性的操作指南进行,避免操作方法上的错误;对于无视频分析系统的行为学测试方法,尽量采用多人测试,以求平均值。在行为学方法的选择上,要多样化,如抑郁症的评定,可同时选择自发行为、强迫游泳、糖水消耗量等几个行为学方法,而避免单一方法的假阳性的出现。期望针灸的基础研究设计更合理,行为学的应用更优化。

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Survey of the Application of Behavioral Assessment to Experimental Studies of Acupuncture Treatment for Nervous and Mental Diseases

-,,-,.

,200071,

Behavioral science as an emerging physiology-related science has been widely studied and used, especially in animal experiments in diseases. In studies of the mechanism of acupuncture treatment for nervous and mental diseases, its effect has been evaluated using behavior scores. This article summarizes the application of behavioral science to animal experiments in acupuncture treatment for nervous and mental diseases, points out existent problems and proposes methods for improvement.

Acupuncture therapy; Behavioral assessment; Experimental study; Rats; Mice

1005-0957(2014)03-0278-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.03.0278

2013-09-14

上海市科委课题(10ZR1428800);教育部博士点基金项目(20103107120013);国家自然科学基金项目(81102636)

徐世芬(1975 - ),女,副主任医师,E-mail:xu_teacher2006@ 126.com