口腔癌淋巴管生成及淋巴转移的研究进展

王 通，沈 军

(1天津医科大学，天津300070;2天津市口腔医院)

口腔癌为头颈部常见的恶性肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤的3%，其中口腔颌面部的鳞状细胞癌占80%以上。虽然以手术切除为主的序列治疗对口腔癌原发灶的控制率有了显著提高，但是其5年生存率仍为50%～55%［1］。淋巴道转移是口腔癌各阶段进展的主要转移方式，临床表现为淋巴管癌栓及淋巴结受累。有研究表明，50%的口腔癌患者在首诊时已经发生淋巴结转移［2］。据统计，确诊发生区域淋巴结转移的口腔癌患者5年生存率下降一半左右，所以淋巴结转移被认为是影响患者预后的首要因素。目前，癌细胞转移与肿瘤淋巴管生成的研究仍在探讨中。首先，自上世纪70年代Folkman提出肿瘤组织内血管生成学说以来，大部分研究都集中于血管形成与肿瘤增殖、转移的关系，忽略了淋巴管路在癌细胞迁徙、转移中所起的作用。其次，尚未发现特异的淋巴管内皮标志物，在一定程度上阻碍了口腔癌淋巴管生成的研究。目前，随着血管内皮生长因子(VEGF)-C、VEGF-D、透明质酸酶受体-1(LYVE-1)等淋巴管内皮标记物的发现，肿瘤淋巴管生成的研究迅速起步，研究口腔癌淋巴管生成的机制，抑制其生成的靶点，将有望开辟恶性肿瘤治疗的新途径。

1 淋巴系统的解剖学基础和功能

淋巴系统由淋巴管、淋巴组织和淋巴器官组成。淋巴管主要包括毛细淋巴管、淋巴管、淋巴干和淋巴导管。毛细淋巴管仅由内皮和极薄的结缔组织构成，无周细胞。电镜下，毛细淋巴管外周缺少平滑肌，管周无基膜，管壁菲薄，管腔大，管壁由单层内皮细胞组成，内皮细胞间连接疏松，有较宽的间隙，甚至呈开放状态，故通透性大，大分子物质易进入。生理状态下，淋巴系统的主要功能是将组织间液和大分子物质转运入血液循环，保持组织内正常的体液容量，从而维持内环境的稳定;在机体免疫过程中可将抗原提呈细胞及淋巴细胞逐步运送至外周毛细淋巴管或区域淋巴结，完成免疫应答;另外，还可完成脂肪的消化、吸收功能。

2 肿瘤淋巴管研究的技术进展

2.1 淋巴管注射法 分为直接和间接注射法。直接注射法即将有色溶剂注射于淋巴管或淋巴结内，使其显色后进行观察。由于水银有一定毒性，仅限于对尸体淋巴管进行注射，现逐步被油性注射剂和水性注射剂所取代。间接注射法是将注射用有色溶剂(如1%亚甲蓝、2%～4%的天蓝等)注入组织间隙内，借助注射剂的扩散作用，使其通过毛细淋巴管内皮细胞间隙，进入管腔，进而使毛细淋巴管及下一级淋巴管显色。

2.2 动脉内墨汁—硝酸银注射法［3］即将墨汁—硝酸银注入动脉内来研究淋巴管的方法，适用于活体动物或新鲜尸体标本。首先暴露被检器官的动脉，注入33 g/L硫酸钠溶液，将动脉内及相应器官内的剩余血液冲出，然后注入硝酸银水溶液及墨汁—硝酸银溶剂至该器官呈现黑色，然后用甲醛固定被检器官，切取部分组织经冲洗、乙醇脱水、石蜡包埋、切片并封片等步骤，将切片置于阳光下晒2～3 d，利用紫外线将硝酸银还原为黑色的银颗粒，沉积于内皮细胞上，于显微镜下便可观察淋巴管及其内皮细胞的结构。

2.3 淋巴管造影法 淋巴管造影法是将X线阻射的物质注入淋巴管，通过X线透视观察显影的淋巴管或淋巴结。常用的造影剂有稀碘油、碘酞葡胺等，临床常用Patent蓝行皮下注射，直接将碘油制剂注入淋巴管行造影术，进行肿瘤淋巴道转移的相应研究。

2.4 酶组织化学染色法 根据某些酶等化学成分的含量在淋巴管和血管中的差异来区分淋巴管和血管，适用于新鲜标本。较特异的方法是5’-核苷酸酶—碱性磷酸酶双重染色法，淋巴管及毛细淋巴管呈棕色或褐色，而血管及毛细血管呈现蓝色。毛细淋巴管对5’-核苷酸酶呈阳性反应，而毛细血管对碱性磷酸酶呈阳性反应，根据淋巴管内皮细胞与毛细血管内皮细胞酶谱活性差异及底物与之反应后不同的产物，鉴别淋巴管及血管，进而行淋巴管相应的研究。

2.5 免疫组织化学法 应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。因毛细淋巴管相对于毛细血管内皮细胞少、且缺乏完整的基底膜，用Ⅳ型胶原及B27双重免疫组织化学染色使毛细淋巴管呈红色，而毛细血管呈深蓝色。但肿瘤血管基底膜在某些特定条件下有时也不连续或缺如，在行免疫组化染色时会出现假阳性结果，故该方法可靠性尚不稳定。

3 淋巴管内皮标记物

近年来，一些淋巴管内皮细胞标记物被发现，有关淋巴管生成的研究有了极大突破，这对于鉴别毛细淋巴管和毛细血管内皮，研究淋巴管内皮细胞来源、特性及淋巴管生成的调控和靶向治疗都有重要意义。

3.1 血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)VEGF是一组特异性作用于血管内皮细胞的多肽，VEGF家族包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 及胎盘生长因子(PLGF)等，有促进血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成等作用。该家族的受体为酪氨酸激酶受体，主要包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3以及2个无活性受体。VEGF-C是VEGF家族中重要的组成部分，可与VEGFR2结合促进血管生成;又可与VEGFR3结合，促进淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，调控淋巴管的发芽、增生，参与淋巴管的生成过程，并对胚胎发育和肿瘤的生长转移起重要调节作用。

VEGFR3是第一个被发现的淋巴管内皮标记物，作为特异性表达于淋巴管内皮的分子之一，可以简单而准确地识别淋巴管，其表达状况与肿瘤的淋巴道转移也有密切联系［4］。但是对VEGFR3的深入研究发现，其不仅表达于淋巴管内皮细胞，在某些生理和病理状态下也表达于人类正常的乳腺组织、鼻黏膜组织、有孔毛细血管的内皮细胞、慢性炎症反应和肿瘤相关的血管内皮细胞［5］。

3.2 LYVE-1 LYVE-1是含有332个氨基酸残基的膜蛋白，与CD44同源，均匀分布于淋巴管内皮细胞的基底面和胞腔面，参与淋巴管内皮对透明质酸的结合和吸收;还参与肿瘤细胞及白细胞的归巢。LYVE-1是第一个在淋巴管内皮上发现的透明质酸受体，也是一种比较可靠、特异性较好的淋巴管内皮细胞标记物。最近研究发现，该受体也表达于肝血窦内皮细胞和肾、肾上腺、胰、甲状腺上皮细胞，且肿瘤内约有10%的LYVE-1阳性脉管是血管。

3.3 肾小球足突细胞膜蛋白(Podoplanin)Podoplanin最初发现于肾小球足细胞表面，是一种黏液样跨膜糖蛋白［6］。Podoplanin特异性表达于淋巴管内皮，而在血管内皮中无表达，可作为淋巴管内皮标志物，并逐步用于肿瘤淋巴管生成及其淋巴转移的研究中，其在多种肿瘤中的淋巴管内皮细胞表达上调。Parr等［7］认为在结肠癌及周边组织中淋巴管形成增加，且Podoplanin表达增高与肿瘤的淋巴结转移高度相关。

3.4 同源异型核转录因子1(Prox-1)Prox-1在内皮细胞中仅特异性地表达于胚胎淋巴管、成人正常组织淋巴管及肿瘤内淋巴管，在非内皮细胞中可以存在于晶状体、心脏、神经系统等组织器官中［8］。Wigle等［9］对小鼠模型淋巴管研究发现，Prox-1缺失会影响淋巴管的发育，甚至导致机体死亡，但不会影响血管生成。Chang等在研究非小细胞肺癌组织中Prox-1的表达时发现，Prox-1表达水平越高，肿瘤的TNM分级越高，且淋巴结转移率也相应增高，认为Prox-1可以作为预测非小细胞肺癌淋巴管转移的重要蛋白。

3.5 多功能非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白(NRPs)NRPs包括NRP-1和NRP-2。近年研究发现，NRPs可能与淋巴管生成、肿瘤淋巴管新生及淋巴道转移有密切关系［10］。Xu等［11］通过小鼠动物实验模型研究发现，NRPs能调节VEGFR3在淋巴管内皮上的表达水平，进而调控淋巴管的发芽生长，促进成熟小鼠体内淋巴管树的发展和增殖。在肿瘤淋巴管新生及淋巴道转移的研究中也提出了同样的观点。Ochiumi等［12］对进展期结肠癌的研究结果显示，NRP-1高水平表达组淋巴结转移率显著高于低水平组，由此推断，NRP-1表达水平与结肠癌淋巴结转移率相关。此外，Dallas等［13］也提出NRP-2的表达水平与胰腺癌细胞的生长、局部浸润及淋巴结转移相关。

3.6 D2-40 D2-40分子是在生殖细胞肿瘤和胚胎睾丸的精母细胞表面新发现的一种唾液酸黏蛋白，是最新发现的特异性标记淋巴管的鼠来源IgG1单克隆抗体。近来研究发现，D2-40抗体能通过与唾液酸蛋白特异性结合检测肿瘤淋巴管内皮上固定的抗原决定簇，其敏感度和特异性均都高于其他淋巴管内皮的分子标志物［14］。D2-40可用来标识多种肿瘤的新生微淋巴管内皮上的抗原决定簇，该抗原决定簇在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和血管内皮上没有表达［15］。甄乐锋等［16］用 D2-40进行免疫组化染色标记组织淋巴管时发现，其仅在被覆单层内皮细胞的小淋巴管如终末淋巴管显色，为一种特异性较强的淋巴管标记物，对于淋巴管生成的研究具有较好的实用意义。

4 淋巴管生成与肿瘤转移的关系

淋巴转移是肿瘤转移的主要途径之一，也是决定患者治疗方案及预后的重要因素;同时淋巴管的生成对肿瘤的转移起重要作用。早期由于缺乏淋巴管特异性标记物等原因，对于肿瘤淋巴管生成的研究相对滞后，但对于肿瘤淋巴结转移时淋巴管侵袭的理论，还是被大部分学者认可。肿瘤细胞到达淋巴结后，在边缘窦处增殖，由于毛细淋巴管管壁由单层内皮细胞组合，细胞间缺乏紧密连接，且管腔基底膜不完整，有利于肿瘤细胞穿过管壁进入管腔，在肿瘤原发部位或转移器官的淋巴管管腔内聚集成瘤栓，然后进入下一级淋巴管，最终以阿米巴样运动的形式进入淋巴结实质［17］。

2009年，Mohammed等［18］在乳腺癌的研究中证实了癌巢内部无淋巴管存在，仅在癌灶边缘及癌周组织中发现毛细淋巴管。肿瘤内存在新生淋巴管，但其管壁菲薄，细胞间连接疏松，管腔常呈塌陷或闭塞状态，为非功能性淋巴管［19］;而瘤周淋巴管常弥漫分布于肿瘤周围，管腔呈扩张状态，更有利于肿瘤细胞的侵入。目前，VEGFR3介导的信号通路是公认的淋巴管生成的主要调控机制;另外，Prox-1作为淋巴管生成的基本调控因子也起至关重要的作用。肿瘤细胞可以通过分泌VEGF-C、VEGF-D、Prox-1等调控因子来诱导淋巴管生成，并促进肿瘤细胞的淋巴转移。

淋巴管密度及单位面积中毛细淋巴管及淋巴管的数目，是客观评估肿瘤新生淋巴管的重要指标，并可以预测淋巴结转移的风险及预后。相关研究发现，瘤周淋巴管密度显著高于瘤内淋巴管密度，且瘤周淋巴管密度与肿瘤淋巴结转移高度相关。

5 口腔癌淋巴管生成及淋巴转移

研究发现，口腔癌的癌组织中存在淋巴管内皮细胞增殖及淋巴管增生。危由春等［20］认为VEGF-C可诱导口腔癌淋巴管内皮产生，促进其增殖和迁移，导致淋巴管在癌巢周围增生，且这种增生的淋巴管与正常组织淋巴管在形态结构及组织学上有较大差异。李慧文等［21］选取62例舌鳞癌组织，以VEGFR3标记其淋巴管，发现阳性淋巴管主要分布在癌组织周围，癌间质未见明显成形淋巴管，认为其原因是癌巢肿瘤细胞的膨胀性生长压迫间质淋巴管使其闭锁。

口腔颌面部有丰富的淋巴管通路及吻合支，为癌细胞的淋巴转移提供了便利途径;而且舌、颊等组织由于运动频繁，也为癌细胞的早期扩散提供了有利条件。口腔癌的淋巴转移往往通过淋巴管转移到区域淋巴结，淋巴结转移是原发灶复发及生存率降低的重要原因。目前通常通过切除已肿大的淋巴结及临床上怀疑存在转移的区域淋巴结行病理检查，确定是否存在淋巴结转移;然而，已有文献报道口腔鳞癌存在颈淋巴结隐匿性转移，仅依靠临床TNM分期评估患者颈淋巴结状态及预后是远远不够的。

鉴于淋巴管生成在口腔癌淋巴转移中的重要作用，抗淋巴管生成治疗有望成为新的口腔癌治疗方法，但这种治疗是否对正常组织淋巴管及血管的正常生理功能有不良影响，还有待进一步研究。早期采取分子生物学等方法检测VEGFR3、LYVE-1等淋巴管内皮标记物，可为口腔癌的诊断及预后评估提供重要的参考信息。

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