鲢鱼致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

万玉华 彭章华 杨 军 汪 勇 彭明珍

(1.泸县牛滩镇畜牧兽医站,四川泸县 646105; 2.泸县畜牧局,四川泸县 646100)

鲢鱼致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

万玉华1*彭章华2杨 军2汪 勇2彭明珍2

(1.泸县牛滩镇畜牧兽医站,四川泸县 646105; 2.泸县畜牧局,四川泸县 646100)

目的:利用实验室诊断技术对某鲢鱼养殖厂发病鲢鱼进行诊断,以期为该场发病鲢鱼的治疗和预防提供技术支持。方法:运用细菌分离培养、生化鉴定对该发病养殖场随机挑取发病鲢鱼进行诊断,利用药敏试验进行治疗药物的筛选。结果:从鲢鱼中分离菌株19株,其中13株为嗜水气单胞菌菌株,检出率为65.4%。药敏试验结果筛选出的药物为该病治疗和预防提供了参考依据。

鲢鱼;致病性嗜水气单胞菌;分离;鉴定

1 材料

1.1 病料来源

随机选取15条来自发病养殖场的鲢鱼。

1.2 主要试剂及仪器

普通培养基、AHM鉴别培养基、脱脂奶蔗糖蛋白胨平板、氧化酶试剂、H2O2酶试剂；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒；2×Taq PCR Master Mix；VitekGNI+鉴定卡片。显微镜，生化培养箱。

1.3 试验动物

15～18g健康小白鼠20只。

2 方法

2.1 细菌分离和初步鉴定

将抽取发病鲢鱼处死，无菌操作采集其肝脏、脾脏、心血等组织，划线接种于营养琼脂平板28℃培养18～24h。挑取典型菌落纯化培养，革兰染色镜检观察细菌形态，并用纯化菌落进行氧化酶、过氧化物酶试验。

2.2 培养特性试验

2.2.1 AHM培养基鉴定

将纯菌落接种于AHM培养基，28℃过夜培养，观察颜色反应，并作穿刺培养，观察运动情况。

2.2.2 主要毒力因子试验

将纯菌接种于脱脂奶蔗糖蛋白胨平板28℃培养过夜，观察脱脂奶平板上菌落周围是否出现清晰透明的溶蛋白圈，以确定菌体是否产生胞外蛋白酶。

2.3 生化鉴定

采用微量发酵管法检测分离菌株生化特性，28℃恒温培养7d，测定包括糖发酵试验、氨基酸代谢试验、细菌酶试验、耐盐试验等

2.4 人工感染试验

将鉴定为嗜水气单胞菌的分离株进行纯培养低速低温离心后，用无菌生理盐水悬浮至原体积进行小鼠感染试验。小鼠共分成4组，分别为对照组和试验1～4组（5只/组），对照组腹腔接种无菌生理盐水0.2ml，试验1～3组分别腹腔接种0.2 ml，1组接种浓度为3×104cfu/ml，2组接种为3×105cfu/ml，3组接种浓度为3×106cfu/ml。感染小鼠后，观察24h内发病情况，死亡小鼠立即剖解。24 h后，处死所有小鼠，无菌操作观察其主要的病理剖解变化并分离目的菌，培养并鉴定。

2.5 药敏试验

选取16种药敏纸片，分别检测抑菌圈直径，参照抗菌药物敏感试验标准确定各种药物对病原菌株的敏感性。

3 结果与分析

3.1 病原菌的分离

分离该疑似嗜水气单胞菌菌落边缘整齐、光滑、微凸，呈无色或淡黄色。显微镜下观察为两端圆形，至球菌状，单个、成对或成链排列，直径1.0～4.4µm的革兰氏阴性短杆菌；以极生鞭毛运动，一般单鞭毛。分离株分别命名为L1-L19进行后续试验。

3.2 氧化酶试验

19株纯化菌在营养琼脂平板培养基28℃过夜培养后，氧化酶试验结果表明：绝大部分菌株氧化酶试验为阳性。

3.3 AHM鉴别培养基

实验结果为：顶部为紫色，底部为淡黄色；细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性，部分菌株顶部黑色，少数产有气泡。

3.4 主要毒力因子检测结果

10 g/L脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上菌落周围出现清晰透明的溶蛋白圈。

3.5 生化鉴定结果

分离的19株菌株经过生化鉴定，其中14株生化鉴定结果与嗜水气单胞菌生化特性相近。

3.6 DNA扩增序列测定于分析

对分离出的各株纯培养分细菌进行PCR反应，测序结果，序列分析表明其中13株菌为嗜水气单胞菌。

3.7 动物试验

试验组1～3小白鼠接种后，2、3组小鼠均在24h内死亡，1组死亡2只，另外3只小鼠表现为弓背、耸毛、运动迟缓、食欲不振，双眼半闭、呼吸急促等症状。24后处死所有小鼠，无菌操作解剖死亡及处死小鼠，试验组小鼠分离出目的菌，对照组小鼠24 h无不良反应，未分离出目的菌。

3.8 药敏试验

药敏试验结果表明。分离菌株对头孢三嗪、头孢哌酮钠、四环素、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、呋喃唑酮敏感，对新生霉素、麦迪霉素、链霉素、利福平、红霉素、林可霉素、头孢拉定、氨苄西林钠不敏感。

4 讨论

（1）从鲢鱼中分离的病原菌，观察其在营养琼脂培养基上生长菌落形态及其在1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上培养菌落周围出现清晰的透明溶蛋白圈，AHM鉴别培养基上阳性表现顶部仍为紫色，底部为淡黄色；细菌沿穿刺线呈刷状生长部分菌株顶部黑色都与嗜水气单胞菌相符。对生化鉴定为嗜水气单胞菌的分离菌株进行PCR扩增测序比对，表明分离菌与嗜水气单胞菌同属一个类群。胞外蛋白酶是嗜水气单胞菌与其毒素的分泌有密切的关系，因而对胞外蛋白酶的检测也作为嗜水气单胞菌鉴定的重要方面。试验中总共从鲢鱼中分离菌株19株，其中为嗜水气单胞菌的菌株为13株，检出率68.4 %。对分离的菌株做人工感染试验，

（2）通过药敏试验筛选出头孢三嗪、头孢哌酮钠、四环素、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、呋喃唑酮对该致病性嗜水气单胞菌具有良好的抑制作用，在该鲢鱼养殖场在治疗本病的时可起到指导作用。

（3）对于本病最根本的方法还是预防为主，防治结合。养殖场需加强饲养管理，保证良好的水质、适宜的养殖密度，在夏季时注意水温的控制，清塘时彻底消毒。同时要加强平时对养殖鲢鱼应随时注意观察，做到早发现，早治疗。发病后，对未被感染的池子严格进行隔离，对发病鲢鱼若存在治疗价值进行积极救治，若治疗价值不大，及时进行淘汰处理，并对鱼塘进行清塘消毒。

[1] 梁婷，丁建华，冯佳，等.鲢鱼对浮游植物滤食的选择吸收[J].当代水产，2014，（1）：73-74.

[2] 张舵，蔡懋沅，王柏铮，等.白鲢的养生价值探讨[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5381-5383.

[3] 沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2008，27（1）：78-86.

万玉华（1972-），女，大学本科，长期从事动物疾病诊疗。