茶树蛋白质组学研究进展

程晓梅，黄建安,2，刘仲华,2，李 勤

（1. 湖南农业大学园艺园林学院茶学教育部重点实验室，湖南 长沙410128；2. 湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙410128）

蛋白质组概念是由澳大利亚学者MarcWilkins 和Keith Williams 首次提出，并由Wasinger 等第一次在出版物中使用，它研究的核心内容是蛋白质的动态变化和动态行为，即通过分析某一生物体、组织或细胞内的蛋白质组成成分、表达水平、修饰状态和功能，了解蛋白质之间的相互作用及其联系[1]，进而从整体水平上研究蛋白质的组成和调控规律[2]。植物蛋白质组学的研究落后于单细胞原核生物和真核生物蛋白质组学，而且与动物和酵母蛋白质组学相比还不完善，这与植物本身特点有关[3]。近年来，随着蛋白质组学研究方法和技术体系的不断完善，为植物蛋白质组学的研究提供了良好的技术平台。目前，蛋白质研究的技术手段主要包括蛋白质样品制备、电泳分离技术[4]、色谱分离技术[5]、质谱鉴定技术与生物信息学分析[6-8]等。

1 植物蛋白质组学产生的背景及意义

蛋白质组学是生物研究中发展最快的领域之一，它是在基因组学的研究成果和高通量的蛋白质分析鉴定技术得到突破的背景下产生的一门新兴学科，基因组研究的发展是蛋白质组学产生的重要前提。植物蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支，是分子生物学时代的重要组成部分，为未来研究和发展植物生理学提供了坚实的基础和理论依据。通过植物蛋白质组学的研究，能快速分离鉴定与控制植物重要农艺性状的蛋白质，运用逆向遗传学方法鉴定基因功能，再利用基因工程手段将优良的农艺性状基因转化农作物，以进一步提高作物产量、品质和抗逆性。

2 植物蛋白质组学研究的主要内容

植物蛋白质组学研究的主要内容包括：（1）植物环境蛋白质组学，研究与环境因素相关的蛋白质，主要是植物在生物（如病虫害）和非生物（如干旱、高低温、高盐等）逆境胁迫条件下生理代谢、调控应答机制、生物间的相互作用机制以及植物激素的调节作用等。Wang 等为了研究植物的耐铝机制，采用iTRAQ 标签的定量蛋白质组学技术研究了水稻幼根响应铝胁迫的蛋白质组学，发现铝敏感和耐铝的品种之间有106个差异蛋白点，耐铝品种中与糖酵解途径有关的酶的表达上调，通过qPCR 表明其中的8个蛋白质可能与耐铝性有关[9]。（2）植物遗传多样性蛋白质组学，是以蛋白质组学标记为纽带联系基因多样性和表型多样性，进而了解植物种内和种间进化趋势，一个自然群体的遗传变异程度以及进行品种鉴定。Song 等发现小麦杂种及其亲本间的一些差异蛋白，它们与能量代谢、信号转导、细胞生长、疾病及防御等有关[10]。（3）植物突变体蛋白质组学，能够揭示一些植物生理生态建成的机制，明确植物突变的分子机理，为植物发育分子生物学研究与应用提供新的研究资料。邵勤通过研究薄皮甜瓜叶色黄化突变体9388-1 和突变亲本的蛋白质组学，发现黄化突变体的叶绿体核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、叶绿体放氧增强蛋白1 表达下调，可能与叶色黄化有关[11]。（4）植物发育相关蛋白质组学，主要研究每一个特定时期植物各个组织器官及细胞器内蛋白质的表达差异。Zhang 等利用2-DE 技术研究杂交水稻LYP9 及其亲本在分蘖、开花、灌浆3个时期蛋白质组学的动态变化，亲本和杂交LYP9 中与光合作用、糖酵解和防御有关的蛋白在开花和灌浆期表达较分蘖期均上调，杂交品种更明显[12]。

3 茶树蛋白质组学研究应用进展

茶树是一类多年生常绿叶用经济植物，原产于我国西南地区。随着人们对茶叶研究的不断深入，茶树在基因组方面的研究已经取得了长足进展。1994年，Takeuchi 等构建了第一个茶树cDNA 文库，获得了很多重要的茶树基因[13]。陈亮等以龙井43 无性系新梢和实生苗新生幼根为材料，构建了我国第一个茶树新梢与幼根cDNA 文库[14]。黄建安等构建国内首张茶树遗传图谱[15]。Shi 等首次利用高通量Illumina 测序技术获得茶树转录组深度数据库，为茶树研究基因表达、基因组和基因功能分析提供了重要的技术平台[16]。杨华等利用茶树转录组的高通量测序技术获得的127 094 条Unigenes，共发掘了12 242个茶树转录组SSR 功能性标记[17]。这一系列茶树基因组方面的研究结果为开展茶树蛋白质组学的研究打下了坚实的基础。

3.1 茶树蛋白质组学技术体系建立

随着茶树基因组研究的深入，茶树蛋白质组学研究也在逐步展开。林金科等以茶树芽叶为材料，通过优化双向电泳体系中蛋白样品制备、电泳和染色等条件建立了一种适合于茶树蛋白质组学研究的改良方法，解决了茶树芽叶中富含色素、多酚类化合物及其氧化产物等对双向电泳严重干扰的问题[18]。李勤等通过比较TCA/丙酮沉淀法、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和改良的Tris-HCl抽提法，发现Tris-HCl 抽提法适合于茶树蛋白质双向电泳样品制备[19]，并成功应用于安吉白茶生育期间蛋白质组学研究[20]。任燕通过对总蛋白提取方法、IEF 聚焦条件和SDS-PAGE 电泳条件等的优化，建立了一套适合于茶树雌蕊总蛋白质双向电泳的技术体系，可以获得清晰、分辨率高、重复性好、碱性蛋白得到有效分离的双向电泳图谱[21]。

3.2 蛋白质组学在茶树抗旱研究中的应用

水是植物生长必不可少的环境因素，缺水条件下植物可能发生枯萎甚至死亡。植物在干旱条件下其形态指标、生长指标、生理生化指标都会发生不同程度的变化。近年来，关于植物干旱胁迫下的蛋白质变化已成为植物逆境研究领域中的热点。庄重光研究了不同水分处理下铁观音茶树叶片的差异蛋白质组学，发现随着茶树叶片水势的降低，蛋白质表达出现逐渐上升或下降的趋势，表达丰度差异达3.0 倍以上的有56个蛋白点，其中上调表达31个，下调表达25个。同时发现不同水分处理显著影响了参与光合作用的蛋白质表达情况[22]。张宝千也研究了不同灌溉情况下铁观音茶树蛋白质的表达差异，发现他们之间表达丰度在3.0 倍以上的蛋白点有56个，其中4个蛋白点表达丰度差异在5.0 倍以上[23]。郭春芳等分析了茶树幼苗在聚乙二醇模拟干旱胁迫下叶片蛋白组变化后发现，PEG 处理后叶片完整蛋白的表达量下降，降解片段的表达量上升，总蛋白量减少，并鉴定出14个不同的蛋白点，其中5个点是同一个蛋白，另9个是PEG 胁迫响应蛋白，它们对揭示茶树响应干旱胁迫的分子机理奠定了基础[24]。Chen 等研究了茶树新鲜种子和经过12 h 干燥处理的种子蛋白组的变化，谱图分析显示干燥后23个与抗性、代谢和氧化还原相关的蛋白得到上调[25]。周林等探究了干旱胁迫下外源ABA 对温室中培养的茶树叶片蛋白质组的影响，发现18个差异蛋白点，其中2个表达上调的蛋白与糖酵解和光反应体系Ⅱ有关。同时发现通过外源脱落酸对不同干旱时间刺激的茶树叶片进行处理，检测到21个差异蛋白点与干旱胁迫有关，结果表明茶树在干旱胁迫下，ABA 在改善蛋白质运输、碳代谢和抗性蛋白的表达方面发挥着重要作用[26]。

3.3 蛋白质组学在茶树抗寒研究中的应用

植物抗寒性是指植物忍耐和抵抗低温的能力，在低温胁迫下植物的蛋白质组成和表达量发生了变化。茶树具有喜温畏寒的特性，不同茶树品种因原产地和遗传差异对低温胁迫表现出不同的适应能力。高永亮比较了4℃低温和25℃室温条件下舒茶早茶树叶片蛋白质组的变化，发现低温处理后上调表达的蛋白点有31个，减弱表达的有15个，这些差异蛋白点可能与低温胁迫有关，对7个蛋白的肽质量指纹图谱进行鉴定，6个为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶蛋白家族，茶树可能通过他们的表达上调来抵御低温对茶树光合作用的负效应，增加碳水化合物的合成；1个为转酮醇酶，促使物质的相互转换，以减少寒害[27]。Hu 等研究了福鼎大白茶在0℃以上和-2℃下叶片的蛋白质变化，发现38个重复性好的差异蛋白点，包括热休克蛋白70 家族，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，ATP 合酶等，这些蛋白质与茶树的抗寒机制密切相关[28]。

3.4 蛋白质组学在茶树其他抗性研究中的应用

杜娟研究了平阳特早茶树在Pb 胁迫下，接种根内球囊霉菌和未接种根内球囊霉菌的茶树叶片中蛋白质组差异，发现与未接种根内球囊霉菌相比，蛋白表达量显著上升的蛋白点有7个，显著下降的有8个。对于这些差异蛋白与茶树抗Pb 胁迫的具体关系仍需进一步探究[29]。

茶树在抵抗逆境胁迫时往往会表现出抗逆性状，合成大量的胁迫诱导蛋白，提高茶树的耐胁迫能力。如何增强茶树生长适应性，提高抗寒、抗旱、抗病等能力，已日益成为茶树栽培生产和品种选育中亟待解决的问题。因此，研究茶树的抗性机制，对茶树种质资源的开发利用、扩大引种范围、品种选育和改良以及茶树栽培生产等都具有十分重要的理论和实践意义。

3.5 蛋白质组学在茶树品质调控研究中的应用

儿茶素类是茶树重要的品质成分及次生代谢产物，与茶树的生长发育和茶叶的色、香、味品质形成关系密切，也是茶叶保健功能的主要成分，所以对高儿茶素含量的茶树的研究意义重大。林金科等通过外源无公害化学因子的诱导使茶树EGCG 含量提高20.15%～25.00%，并发现诱导出现和消失的特异蛋白分别有14种、8种，表达上调和下调相差10 倍的蛋白分别有11种和6种，这些差异蛋白在诱导过程中可能发挥着重要作用[7,30]。张立明等对“云茎63X”、“云茎63Y”和光照诱导的“云茎63Y”三类儿茶素含量依次升高的愈伤组织的蛋白质进行分析，分别得到684、607、568个蛋白点，共检测到14个差异较大的蛋白质，包括谷胱甘肽S-转移酶、WD40蛋白、咖啡酸-O-转甲基酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、果胶甲酯酶等，他们分别参与了类黄酮的合成、转运及调控，乙烯合成、糖酵解途径和信号转导等生理作用[31-32]。

3.6 茶树花粉蛋白质组学研究

茶花粉富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素和活性酶等多种有效成分，具有降血压、抗衰老、增强免疫力等作用。花粉储存的关键就是如何在长期的储藏中花粉继续维持原有的高活力水平，为此Li 等对室温及-20℃低温储存6个月的茶花粉蛋白组进行了比较试验，分别检测到269 和396个蛋白质点，室温储存引起茶花粉内蛋白质损失，而在-20℃温度下应激蛋白，核酸代谢类蛋白，脂肪代谢类蛋白，膜转运蛋白丰度显著升高，与防御和能量代谢相关的蛋白表达下调。这些结果表明，冷冻是保持茶花粉质量的最佳储存方式[33]。

3.7 茶树突变体蛋白质组学研究

通过蛋白质组学方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究可以得到植物遗传学的重要数据，揭示植物生理生态过程的机制，对研究表型突变的内在生化过程提供指导。目前对茶树突变体的研究报道较少，主要集中于某些主要生化成分和基因研究，而对于蛋白质组的研究几乎是空白。安吉白茶是一种低温敏感型的自然突变的白化茶树，李勤等采用Tris-HCI 抽提法提取安吉白茶返白前期、白化期、完全复绿期3个时期的芽叶蛋白质，通过双向电泳技术检测到每个时期约1 000个蛋白点，表达丰度变化在1.5 倍以上的差异蛋白点有60个，对其中26个差异表达蛋白进行鉴定发现，它们是一些与物质及能量代谢、光合作用、蛋白质及RNA 加工有关的抗性蛋白和未知功能的蛋白质。安吉白茶阶段性返白现象和高氨基酸含量可能与这些差异蛋白表达变化有关[20]。

3.8 茶树亚细胞水平的蛋白质组学研究

亚细胞蛋白质组学是蛋白质功能和定位研究的必经之路。目前，大多数蛋白组研究者以亚细胞蛋白质组作为切入点，正将蛋白质组学推向一个更广阔的领域[34]。在植物亚细胞蛋白质组学中研究较多的是叶绿体。人们对于茶树的亚细胞水平的蛋白质组学研究进程还比较缓慢。张立明等通过差速离心法分离茶树叶片的叶绿体，IEF/SDS-PAGE 双向电泳结合银染技术，鉴定得到茶树叶绿体中约有350个蛋白质点，主要分布于等电点在3～5，并检测到茶树叶绿体内含有儿茶素合成相关酶PAL、DFR/LAR 和ANR[32,35]。

4 茶树蛋白质组学研究瓶颈和发展前景

蛋白质组学的研究作为功能基因组学的重要支柱，是当今生命科学领域的前沿，不仅可以实现与基因组的对接与确认，而且还可以广泛推动生命科学的基础学科及分析、信息、材料等应用科学的发展。目前，植物蛋白质组学发展迅速，并取得了一些可观的成果。而关于茶树蛋白质组学的研究一直发展很慢，原因有：⑴相比于拟南芥和水稻等模式植物，茶树蛋白质组学处于初级阶段，蛋白提取过程中干扰物质较多，蛋白样品的制备较困难；⑵截止目前，茶树没有完整的基因组，数据库还不完善，即现有的蛋白质组局限于对已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析；⑶蛋白质组学的有些技术难将细胞组织内多种痕量调控蛋白分离显示出来，而这类蛋白对于基础与应用研究是极为重要的；⑷现有的质谱技术在蛋白鉴定中高效灵敏，但价格昂贵，技术推广受到很大的限制。

我国茶树品种多样，种质资源丰富，分布区域广泛。尽管当前茶树蛋白质组研究的深度与广度仍不及模式植物，但是近年来对茶树蛋白质组学的研究，使得茶树蛋白质的提取和鉴定技术逐渐被优化和完善，相关研究也为茶树功能基因组学研究的深入开展创造了新的起点。针对以上问题，随着2D-HPLC、2D-CE 及LC-CE 等新型分离技术和新理论的出现，生物质谱技术及生物信息学工具的进一步完善，茶树蛋白质组学的研究将更加深入和广泛，尤其是对于某些具有特殊优良性状的茶树品种，如具有强抗寒、抗旱、抗病虫能力的“紫鹃”和简单儿茶素含量较高的江华苦茶等，对它们的研究为认识茶树的生长、发育、进化规律和代谢调控等生命本质指明方向。

[1]Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa‐Poljak A，etal.Progresswith gene‐product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis，1995，16(1)：1090-1094.

[2]Dunn MJ.ProteomicsComesofAge[J].Proteomics，2014，14(1)：1-2.

[3]Van Wijk KJ.Challenges and prospects of plant proteomics[J].Plant Physiology，2001，126(2)：501-508.

[4]PomastowskiP，BuszewskiB.Two-dimensionalgelelectrophoresis in the light of new developments[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2014，53(1)：167-177.

[5]Cox J，Mann M.Quantitative，high-resolution proteomics for data-driven systemsbiology[J].Annual review ofbiochemistry，2011，80：273-299.

[6]Wu C，Dill AL，Eberlin LS，et al.Mass spectrometry imaging under ambient conditions[J].Mass spectrometry reviews，2013，32(3)：218-243.

[7]林金科.茶树高EGCG的种质资源及外源诱导研究[D].福州：福建农林大学，2003.

[8]周琼琼，孙威江.适用于茶树蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立[A].第十六届中国科协年会—分12茶学青年科学家论坛论文集[C].昆明：中国科学技术协会，2014.

[9]Wang ZQ，Xu XY，Gong QQ，et al.Root proteome of rice studied by iTRAQ provides integrated insight into aluminum stress tolerance mechanisms in plants[J].Journalofproteomics，2014，98：189-205.

[10]Song X，Ni Z，Yao Y，etal.Wheat(Triticum aestivum L.)root proteome and differentially expressed rootproteins between hybrid and parents[J].Proteomics，2007，7(19)：3538-3557.

[11]邵 勤.一个新的甜瓜叶色黄化突变体研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2013.

[12]Zhang C，Yin Y，Zhang A，et al.Comparative proteomic study reveals dynamic proteome changes between superhybrid riceand its parents at different developmental stages[J].Journal of plant physiology，2012，169(4)：387-398.

[13]Takeuchi A，Matsumoto S，Hayatsu M.Chalcone synthase from Camellia sinensis:isolation of the cDNAs and the organ-specific and sugar-responsive expression of the genes[J].Plant and Cell Physiology，1994，35(7)：1011-1018.

[14]Chen L，Zhao L-p，Gao Q-k.Generation and analysis of expressed sequence tags from the tender shoots cDNA library of tea plant()[J].PlantScience，2005，168(2)：359-363.

[15]黄建安，李家贤，黄意欢，等.茶树AFLP分子连锁图谱的构建[J].茶叶科学，2005，25(1)：7-15.

[16]Shi C-Y，Yang H，Wei C-L，et al.Deep sequencing of the Camellia sinensis transcriptome revealed candidate genes for major metabolic pathways of tea-specific compounds[J].BMC genomics，2011，12(1)：131.

[17]杨 华，陈 琪，韦朝领，等.茶树转录组中SSR位点的信息分析[J].安徽农业大学学报，2011，38(6)：882-886.

[18]林金科，郑金贵，袁 明，等.茶树蛋白质提取及双向电泳的改良方法[J].茶叶科学，2003，23(1)：16-20.

[19]李 勤，黄建安，刘仲华，等.茶树蛋白质双向电泳样品制备技术研究[J].茶叶科学，2011，31(3)：173-178.

[20]李 勤.安吉白茶新梢生育期间蛋白质组学及茶氨酸体外生物合成的研究[D].长沙：湖南农业大学，2011.

[21]任 燕，陈 暄，房婉萍，等.茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立[J].茶叶科学，2013，33(5)：420-428.

[22]庄重光.不同水分处理下铁观音茶树的生理机制及其差异蛋白质组学研究[D].福州：福建农林大学，2008.

[23]张宝千.铁观音茶树应对调亏灌溉的生理与分子机理分析[D].福州：福建农林大学，2013.

[24]郭春芳.水分胁迫下茶树的生理响应及其分子基础[D].福州：福建农林大学，2008.

[25]Chen Q，Yang L，Ahmad P，et al.Proteomic profiling and redox status alteration of recalcitrant tea (Camellia sinensis)seed in response to desiccation[J].Planta，2011，233(3)：583-592.

[26]Zhou L，Xu H，Mischke S，et al.Exogenous abscisic acid significantly affectsproteome in tea plant(Camellia sinensis)exposed to droughtstress[J].HorticultureResearch，2014，1(29)：1-9.

[27]高永亮.茶树叶片抗寒相关蛋白的筛选[D].合肥：安徽农业大学，2011.

[28]YongguangH，Yongzong L，Jian L.Comparativeproteomicsanalysisof tea leavesexposed tosubzerotemperature:Molecularmechanismoffreezeinjury[J].International Journal of Agricultural and Biological Engineering，2013，6(4)：27-34.

[29]杜 娟.根内球囊霉菌对茶树抗铅胁迫能力的调节效应[D].郑州：河南农业大学，2013.

[30]林金科，郑金贵，袁明，等.外源诱导提高茶树EGCG含量过程的蛋白质组差异分析(英文)[J].茶叶科学，2005，25(2)：109-115.

[31]张立明，王云生，高丽萍，等.茶树不同儿茶素含量愈伤组织的蛋白差异分析[J].中国农业科学，2010，43(19)：4053-4062.

[32]张立明.基于茶树儿茶素生物合成的蛋白质研究[D].合肥：安徽农业大学，2010.

[33]Li J，Chen J，Zhang Z，et al.Proteome analysis of tea pollen(Camellia sinensis)underdifferentstorage conditions[J].Journalofagriculturaland food chemistry，2008，56(16)：7535-7544.

[34]齐 欣，崔继哲，朱宏.叶绿体的蛋白质组学研究进展[J].现代生物医学进展，2007，7(3)：440-442.

[35]张立明，刘亚军，王云生，等.茶树叶绿体及其蛋白的分离研究[J].激光生物学报，2011，20(6)：802-808.