抗旱相关基因及其遗传工程

王瑞云，杨阳，李润植，郭红媛

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷030801；2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原030031）

由于人口骤增及气候变暖引起的水资源短缺是当前世界范围内农业面临的极大挑战。到本世纪末，高浓度温室气体引发的全球性干旱将成为农作物生存面临的巨大威胁［1］。全球性水资源缺乏影响种植业的可持续性，农业用水约占人类消费水资源的75%，在许多发展中国家，灌溉用水则占到90%以上［2］。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养活着超过全球一半的人口，局域性干旱甚至可使水稻减产超过80%［3］。因其物种自身对水分缺失的敏感性，水稻的种植模式将会随地下水资源的枯竭发生改变［4］。与水稻相比，玉米则比较耐旱，但在传粉和胚胎发育期对干旱同样敏感［5］。

与动物可以通过运动寻找易居处所不同，植物由根系固着在土壤中，不能自主更换位置，但是经过亿万年的进化，其可以通过改变形态及生理代谢来适应环境。首先，植物抗旱力的高低主要决定于地下根系的吸水力、地上枝系的保水力、气孔对水分的蒸腾力以及植株整体对季节性缺水的适应力等方面［6］。第二，在分子水平上，植物利用信号分子（如脱落酸ABA）启动多种胁迫响应基因以合成蛋白，这些蛋白可以通过减缓营养及生殖发育、积累渗透保护剂及降低蒸腾等过程来增加植物耐旱性［7］。

已经发现了众多干旱响应基因及信号通道［8～10］，如 ABA、水通道蛋白等特定分子［11］、顺式作用因子［12］、长距离信号［13］、信号通道［14］。上述基因中有些已运用到玉米、水稻、油菜、大豆等作物中，并初见成效［15～17］。下面就从胁迫应答转录调控因子、转录后RNA／蛋白修饰因子等抗旱相关基因的发掘和应用方面作一综述。

1 响应干旱胁迫的转录调控因子（Transcription factor：TF）

干旱、高盐等非生物胁迫通常会诱导编码转录因子的基因表达，基因调控通道集中于转录水平，调控基因间的互作以及调控基因和靶基因间的互作引起基因的时空表达。目前在拟南芥转录因子数据库中共有1690个TF，属于50余个转录因子家族［18］；At Reg Net数据库的66个TF中有些由干旱胁迫诱导。bZIP转录因子、AP2／EREBP、NA M （无 顶 端 分 生 组 织 ）、ATAF1－2、CUC2（NAC）、CCAAT绑定和锌指等家族研究较多［18，19］，其在干旱胁迫响应中起重要作用，其表达可以提高作物抗旱性。

1.1 WRKY转录因子

WRKY转录因子是植物中最大的转录调控家族之一，含有WRKY结构域（由高度保守的60个氨基酸组成），单个WRKY转录因子可以调控多个不同的生理代谢过程和响应环境胁迫［20］。WRKY c DNA最先从红薯（SPF）、野燕麦（ABF）、大麦（Pc WRKY）和拟南芥 （ZAP1）中克隆，随后在拟南芥中发现至少有70个WRKY转录因子参与了植物生长发育及对生物胁迫的调控［21］。Os WRKY11被高温诱导的热激蛋白（HSP）101启动子调控时，转基因水稻抗旱性提高、叶片萎蔫度降低，热胁迫7 d后对照只有13.4%存活，而转基因株系35S∶DREB2A CA－a的存活率高达88%［22］。大豆Gm－WRKY54基因在拟南芥中过量表达可以诱导DREB2A的表达，增强植株抗旱性［23］。

1.2 锌指蛋白（ZFP）转录因子

在拟南芥基因中约有134个C2 H2型ZFP，它们通过调节DNA－RNA及蛋白间互作而起作用［24］。研究发现，水稻中的ZFP（如 Os ZFP252、DST和ZAT1）为抗旱相关转录因子，过表达的转Os ZFP252基因水稻抗旱性增强［25～27］。干旱胁迫14 d后，转基因植株与野生型相比存活率高出74%～79%［26］。其抗旱性与诱导Os DREB1 A 的过表达相关，OsZFP252可能是Os DREB1 A上游的一个调节子，可以累积较高浓度的游离脯氨酸和可溶性糖。另一方面，锌指蛋白DST通过负调控保卫细胞H2O2来调控气孔关闭，DST敲除的水稻突变体（dst）抗旱性提高［27］。此外，EAR（ERF－相关的抑制）C2 H2 ZFP、ZAT10及胞质ZFP（非转录因子）Osi SAP8均发现与水稻抗旱性有关［28］。ZAT10由DREB1 A／CBF3诱导，在水稻中过表达可增强抗旱性［29］。Osi SAP8由干旱等胁迫诱导，转基因植物可以在缺水条件下存活23 d，而野生型则不能存活［28］。因为C2 H2型ZFP与DREB1通道和H2O2介导的气孔开度均有关，所以C2 H2有望用于作物的抗旱性改良。

1.3 核因子（NF－Y）

NF－Y是植物中普遍存在的转录因子，可以与CCAAT盒结合，由3个亚基组成，拟南芥中分别对应10、13、13个基因［30］。Li等［31］利用功能基因组学方法，在搜索提高植物抗旱性的转录因子及参与逆境响应的小分子RNA时分离出拟南芥NF－Y的B亚基（At NF－YB1）和 A 亚基（At NF－YA5）。At NF－YB1和At NF－YA5均可提高拟南芥的抗旱性。At NF－YB1调节基因是否与 ABA响应及DREB／CBF有关尚属未知，但ABA和干旱均可诱导At NF－YA5在导管和保卫细胞中的活性，以减小气孔开度并调控某些胁迫应答基因。有趣的是，At NF－YA5是由 micro RNA169（mi R169）转录后加工进行调控的，At NF－YA5功能的执行可能存在复杂机制［31］。

在干旱条件下，玉米转Zm NF－YB2（玉米中At NF－YB1的同源基因）基因植株抗旱性增强，表现为叶片卷曲度低、光合效率高、叶片温度低和气孔导度高。虽然在正常水分条件下，转基因植物开花提早、节间缩短，但是干旱条件下，可增产50%，该基因有望用于作物的抗旱性改良［32］。

1.4 脱水响应转录因子

1.4.1 ABA诱导的 TF

ABA绑定蛋白响应元件／ABA响应因子（AREB／ABF）属于植物bZIP转录因子家族，在植物脱水及种子成熟的ABA信号转导中起作用。在拟南芥中已发现75个 AREB／ABF［33］。在对ABA的响应中，活化的AREB／ABF结合到保守的调控顺式元件序列（ACGTGT／GC）上诱导基因ABRE表达，ABA响应元件（ABRE）存在于ABA诱导的基因启动子内。

拟南芥中AREB1／ABF2、ABF3及AREB2／ABF4过量表达可增强植物对ABA的响应、降低蒸腾，是抗旱相关因子［34］。拟南芥ABF3在水稻中过量表达可降低叶片卷曲及萎蔫度［35］。

NAC（NA M、ATAF1－2和CUC2）是植物中特有的转录因子家族，约有100个成员，具有高度保守且与DNA结合的NAC结构域。拟南芥的三个NAC基因（ANAC019、ANAC055 和ANAC072）可由干旱及ABA诱导表达。序列分析发现水稻中有140个候选的NAC／类NAC基因，其中有40个可能与干旱胁迫有关［36］。水稻中4个基因（SNAC1、SNAC2、Os NAC6 和ONAC045）、大豆中的GmNACS、油菜中的Bn NAC5基因均为抗旱相关基因［37～39］。

在干旱条件下，SNAC1基因产生于水稻保卫细胞中，其过量表达可改变气孔开度。在干旱条件下，转SNAC1基因水稻的小穗结实率和坐果率分别比非转基因水稻高出17%～22%和22%～34%，抗旱性增强可能是由于保卫细胞对ABA的敏感性增强而导致气孔开度减小产生［32］。

1.4.2 不依赖于ABA的TF

与AREB／ABF和SNAC对ABA产生响应不同，不依赖于ABA的脱水响应转录因子（DREB／CBF）可与干旱响应元件（DRE）结合。DREB／CBF是植物特有的AP2／ERF转录因子家族，该家族有147个成员［40］。DRE最先在拟南芥RD29 A基因中发现，同时DRE（DREB）或CRT（CBF）结合因子在诱导抗旱基因表达中起重要作用［41］。

DREB1和DREB2均为DRE结合元件（DREB），其中DREB2基因的表达与干旱有关。将水稻的Os DREB1 A基因或者玉米的Zm－DREB1 A基因整合至拟南芥中并过量表达时，拟南芥抗旱性增强［42，43］。

在被子植物中DREB1／CBF通道及DREB1蛋白的功能是保守的。利用DREB1调节子可提高水稻的抗旱性，用35S、ZmUbi、Os Actin1及干旱诱导的Os HVA22p启动子过表达分析转入到水稻的 Os DREB1 A、Os DREB1B、At DREB1 A、At－DREB1和At DREB1C基因，发现含有过表达两种蛋白的株系在干旱胁迫9 d后仍然存活，而对照则全部死亡［25，35］。在干旱条件下，At DREB1A／CBF3在Os HVA22p启动子调控下可以使水稻单产提高11%。与非转基因番茄相比，转35S∶At－DREB1B基因番茄在水分胁迫21 d后，叶片卷曲度及植株萎蔫度均较对照轻，抗旱性增强［44］。与Os DREB1 A和Os DREB1B 不同，Os DREB1F 过量表达的转基因水稻和拟南芥生长正常，但抗旱性增高。通过激活依赖与不依赖ABA的下游基因表达，生长在液体培养基中的转Os DREB1F基因水稻幼苗在干旱胁迫5 h后叶片卷曲和萎蔫程度降低。Os DREB1F也可以由ABA诱导，但不能直接结合 ABRE元件，因此，Os DREB1F 可能是ABA依赖DREB及ABA不依赖AREB通道间的一个分子桥梁。

利用DREB1／CBF提高作物抗旱性的不足之处在于其组成性表达引起的生长缺陷。为了消除该影响，将At DREB1A 基因与渗透诱导的RD29 A启动子相连后转入到小麦中，结果发现转基因植株生长正常且抗旱性提高，且在脱水情况下，转基因小麦比正常幼苗推迟5 d萎蔫［45］。

拟南芥DREB2A是DREB／CBF家族第四组的成员，可由DREB2 A－CA经过缺失特定残基获得组成性活性，通过泛素化修饰DREB2 A组成性激活或者阻断DREB2的降解。在拟南芥中，DREB2 A－CA的过表达可以使抗旱性显著提高［46］。另一方面，转胁迫诱导型或组成性异位表达ZmDREB2 A玉米和转GmDREB2大豆的抗旱性均显著提高［47，48］。

2 胁迫应答中蛋白的翻译后修饰

2.1 蛋白磷酸化

AREB1等转录因子需要由蛋白激酶磷酸化才具有活性，拟南芥604受体蛋白激酶等需要通过转录来参与植物的环境胁迫应答［49，50］。因为 Hogl信号传递途径的关键元件MAPK激酶在高渗信号下的级联反应，促分裂素原活化蛋白激酶（MAPKs）成为研究不同环境对植物刺激的热点话题。与渗透适应相关的蛋白激酶还包括钙依赖蛋白激酶（CDPKs）和CBL相互作用蛋白激酶等。

MAPK级联途径，由三个相互关联的蛋白激酶组成（MAPKKK、MAPKK和 MAPK），在干旱条件下可被激活，在许多信号转导途径中执行功能［14］。拟南芥 MAPK级联途径中约有90个基因，其在玉米和水稻中有多个同系物［51］。在玉米中NPK1的激酶结构域持续活化可使过表达株系抗旱性增强［52］。干旱胁迫下的转基因植株的产量与水分充足条件下的产量相同。其耐旱机制可能是活化的NPK1在干旱胁迫起始时调控了氧化的胁迫应答信号级联，保护光合器官免遭氧化。水稻中有4个NPK1类似基因（Os NPKLs）由干旱胁迫诱导，与染色体1上的抗旱性QTL处于同一个位置［51］。在干旱条件下，干旱诱导的Os HVA22 P启动子和Os Actin1启动子操控的转NPK1基因水稻分别增产28%和11%［25］。

CDPK是植物对环境诱导Ca2＋通道的重要感应器，调控大多数Ca2＋应激蛋白的磷酸化。水稻的OsCDPK7基因在正常条件下保持非活性状态，受到胁迫时被Ca2＋迅速激活，在转基因水稻中持续过表达时，幼苗的抗旱性增强，干旱胁迫3 d后，转基因苗的萎蔫率比非转基因苗减少一半［53］。CIPK是胁迫信号的Ca2＋传感蛋白激酶，在ABA胁迫应答中被Ca2＋与Ca2＋结合蛋白CBL的互作激活［54］。活化的CIPK通过磷酸化下游蛋白组分来完成对Ca2＋信号的转导［55］。拟南芥中至少有10个CBL和25个CIPK，丰富了CBL－CIPK互作的多样性。在水稻和玉米中也发现了CIPK介导的信号途径［56，57］。OsCIPK12 在水稻幼苗中过表达时，水稻抗旱性增强［58］。干旱胁迫后脯氨酸和可溶性糖含量的增加是由OsCI PK12表达而使抗旱性增强的生理表现。其结果是，转基因植株叶卷曲较弱、干旱一周复水后恢复率高于对照33%～57%。CIPK的活性还取决于其与CBL的互作，单独操控CIPK并不一定能提高抗旱性。然而，通过催化激酶结构域的突变或者去除激酶中的自动抑制FISL功能使CIPK保持活化可以改良作物的抗旱性。

Sn RK2／SRK2属于植物特有的激酶家族成员，其活化需要通过ABA或渗透胁迫诱导。Sn RK2.6／SRK2E／OST最先在拟南芥中被注释为由ABA活化的参与气孔开闭调节的蛋白激酶。ABA通过激活特定阴离子通道（如缓慢型阴离子通道：SLAC1）诱导气孔关闭。Sn RK2.6 与SLAC1间物理层面上的互作及磷酸化可将SLAC1活化；相反，SLAC1的活性可能由蛋白磷酸酶2C家族（PP2C）中的特定成员负调控，如ABA不敏感的ABI1的磷酸化作用［59，60］。因此，保卫细胞的运动可能是由一对特定的激酶－磷酸酶的活化／非活化来控制的。

Sn RK2可以磷酸化bZIP转录因子（AREB1、AREB2及 ABI5）的基序，使它们转录活跃。SRK2E（Sn RK2.6）调节拟南芥气孔的关闭［60］，而根尖含量丰富的SRK2C（Sn RK2.8）则介导根中的干旱胁迫信号。拟南芥中SRK2C（Sn RK2.8）的过表达通过上调DREB1等干旱胁迫应答基因以提高抗旱性［61］。基于植物中应激激活Sn RK信号转导途径的高度保守特性，操纵Sn RK在拟南芥中的表达有望对粮食作物进行抗旱遗传改良。

ABA感应过程的关键包括两类蛋白：PYR1／PYL 和 蛋 白 磷 酸 酶 （如 ABI1 and ABI2）［62］。ABI1是对ABA响应的负调节物，当ABA结合在ABI1和PYR1上时被抑制。拟南芥多种ABI1功能同系物失活可以提高对ABA的敏感度及水分利用率［63］。当然，ABA受体蛋白是提高作物耐旱性的最直接方式。然而，由于不同作物中这些受体的高度冗余，以及它们在ABA信号通道下游互作的复杂性，利用这些互作来达到稳产并提高作物的抗旱性程度还需要用精确的网络化工程方法来解决。

2.2 蛋白的聚ADP核糖基化作用

许多非生物胁迫可使细胞中积累活性氧、激活Pol y（ADP－ribose）聚合酶（PARP）和降低 PARP活性，限制 NAD＋的消耗，提高植物抗性。用PARP发夹（hp PARP）结构改造过的PARP活性降低，含有该结构的拟南芥和油菜耐旱性提高，这种抗逆性由NAD＋消耗减少导致［64］。缺乏PARP的植物ABA水平高且过表达ABA应答基因，如参与淀粉代谢和类黄酮生物合成的基因ABF3和RD29A。在干旱条件下，油菜和玉米的转hp－PARP基因植株具有增产效应［65］。由于PARP可能修饰转录调控中的某些染色质相关蛋白和功能，因此有必要对由PARP活性参与的ABA相关基因表达的染色体控制进行深入剖析。

2.3 蛋白的法尼基化（far nesylation）

脂质附着到蛋白上可以促进信号分子和膜脂／蛋白间的疏水性互作，最常见的膜脂修饰包括脂肪酸、类异戊二烯 （如法尼醇far nesol）和糖基磷脂酰肌醇锚。其中，法尼基化最受关注，因为酵母杂交蛋白（如异源三聚体G－蛋白的γ－亚基蛋白RAS超家族成员）需要法尼基化后才能发生作用。法尼基化是在ABA介导下对靶蛋白增加法尼基的蛋白翻译后修饰，法尼基化的蛋白可调节特定的生理和发育过程［66］。法尼基转移酶（FTase）由a和β两个亚基（FTA和FTB）组成。拟南芥FTB功能缺失突变体（era1）可提高对 ABA的响应［67］。ERA1参与调控气孔开度，是ABA响应的负调控产物，说明干旱响应中蛋白法尼基化的潜在作用［68］。利用反义技术和RNAi技术分别下调FTB和沉默FTA可以降低转基因油菜的蒸腾作用并且提高产量（由对照的2440 kg·h m－2显著提高到3086 kg·hm－2）［69］。因为era1 突变体表现出异常的多效性发育，通过使用干旱诱导的RD29A启动子来抑制内源FTA和FTB使其依赖水分胁迫表达。

3 展望

抗旱性是复杂的植物耐受性性状，本文侧重阐述了抗旱相关基因的两种类型及其在作物耐旱性改良中的应用。水稻、玉米和油菜等作物抗旱性遗传改良的成功实施，加之应激代谢物谱［70］、功能基因组学和蛋白质组学等分子遗传工具的使用，可望发掘更多的干旱胁迫响应调控因子，并使其在抗旱性遗传改良中发挥重要作用。

基于各种应激反应通道间存在串扰效应，干旱最终应该与其他逆境（高温、盐和寒冷）进行关联评估，才能获得可靠而有意义的结论。然而，随着全球环境日趋炎热少雨，筛选和培育耐旱作物是适应全球生态环境的需求［71］。已经发现耐旱作物的非编码调控RNA（包括si RNA和mi RNA）、干旱响应的代谢物和渗透保护剂（磷脂信号、热／冷激蛋白的分子伴侣、胚胎发育晚期富含蛋白、甘氨酸甜菜碱、多胺等）在非生物胁迫响应和耐受性中起重要作用，蛋白调控与RNA调控互作可在应激响应中精细调控基因的时空表达［3，72］，抗旱性信号网络有待深入了解，信号通道中的信号元件尚需逐个摸清，通路间的各种串扰亟待剖析，以上种种均是当前乃至今后相当长时间面临的巨大挑战。

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