骨髓间充质干细胞与乙肝病毒的相互作用

曹毅，宋红丽（1.天津医科大学一中心临床学院，天津300192；2.天津市第一中心医院器官移植中心，天津300192）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM MSCs）作为一种易分离、纯化、体外扩增、多能分化的干细胞，在细胞因子的帮助下可以增殖、迁移，分化成肝细胞并具有其功能，同时拥有弱的免疫原性。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）可以感染BM MSCs并在其内表达，导致其增殖匮乏，但不会影响它的免疫表型、向肝细胞分化并具有肝细胞样作用的能力。同时BM MSCs可以通过消除在其细胞内的HBV而抵制其长期感染机体。所以研究者们考虑使用BM MSCs移植疗法来治疗乙型肝炎晚期肝硬化、肝癌的患者，有效减轻排斥反应，为今后的临床应用提供更合适的方法。

BM MSCs是属于中胚层的一类多能干细胞，具有易分离、纯化、体外扩增，自我更新及多向分化能力强、免疫原性弱、移植后很少发生免疫排斥反应和不涉及伦理问题等特点，在细胞治疗和组织器官重建方面的研究中具有广泛的应用前景。病毒性肝炎是一种严重威胁人类健康的常见病，特别是HBV所引起的乙型肝炎。全球约有3亿以上慢性病毒性肝炎及其病毒携带者，而我国约有1.2亿慢性病毒性肝炎感染者。目前原位肝移植是治疗各种肝功能失代偿期、肝衰竭最有效的治疗方法，但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后的并发症等限制了其广泛应用。近年来，新的干预性治疗通过利用外源性的BM MSCs移植来达到帮助损伤组织或细胞修复与再生的目的。本文围绕BM MSCs的特性、它与HBV的相互作用，其移植入体内的影响的国内外最新研究进展进行综述。

1 BM MSCs的特性、来源、体外培养与应用

1.1 BM MSCs的发现、特性及应用

1867年，Cohnheim在研究伤口愈合时，首次提出骨髓中存在非造血干细胞，指出成纤维母细胞可能来源于骨髓。1976年，Friedenstein等［1］从骨髓细胞中培养出这种纤维原细胞，并证实其易贴壁、在体外大量扩增、呈集落样生长，并具有定向分化的特点。1997 年 Prockop［2］、1999 年 Pittenger等［3］先后分别证明了这种纤维原黏附细胞中包含间充质干细胞，具有分化为多种间质组织（如骨、软骨、脂肪和平滑肌）的能力。鉴于这些特点，人们把这群细胞命名为BM MSCs。

BM MSCs是一种具有特征性形态、表型及功能性质的细胞，它能够强表达CD13、CD29、CD44、CD105， 弱 表 达 CD106， 不 表 达 CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45［3］及人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ抗原和HLAⅡ抗原［4］，不表达或低表达移植免疫排斥相关的表面标志 CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L［5］。其中，CD29属于整合素家族，CD105是间充质相关抗原，CD14是单核/巨噬细胞表面标志，CD11a是淋巴细胞功能相关抗原-1，CD34和CD45是造血干细胞（HSC）表面标志，CD31是内皮细胞特异性抗原标志。说明BM MSCs不具备造血干细胞、内皮细胞及移植排斥的特性。

BM MSCs是造血微环境中的主要细胞成分，通过分泌多种细胞因子，如缺氧诱导因子-1a（HIF-1a），诱导产生干细胞生长因子保护细胞和组织［6］；或表达与HSC黏附、归巢有关的黏附分子及细胞外基质（ECM）蛋白［5］，对HSC的生长、增殖、分化起着重要作用。BM MSCs、脐血CD34+HSC和铜螯合剂共培养使HSC增殖明显增加［7］。Koh等［8］发现BM MSCs可能在HSC表观遗传调控中也起了一定的作用。

BM MSCs具有在体外容易扩增的特性，在短时间内可以扩增上千倍。这是BM MSCs广泛应用于实验研究和临床的重要前提。

BM MSCs具有多向分化潜能，在特定的诱导条件下，它不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层组织细胞，而且能够向外胚层组织细胞（如神经细胞［9］、尿道上皮细胞［10］）和内胚层组织细胞（如心肌细胞［11］、肝细胞［12］）分化。Wakitani等［13］将体外扩增的BM MSCs输注给24例进行了高位胫骨切开的膝关节炎患者，42周后缺损部位已被软组织填充并有软骨样组织形成。所以BM MSCs可以用于骨组织工程，参与组织修复。Rodrigo等［14］发现间充质干细胞植入到急性心肌梗死的患者身上是方便且安全的，它能促进血管和心肌细胞的再生。体外的BM MSC可以通过加入细胞因子［15］、与肝细胞或类固醇激素［16-17］混合培养转化成肝细胞、刺激内皮细胞再生、增强纤维基质降解，同时拥有肝细胞的功能。当然所分化细胞所在器官特殊的微环境是BM MSCs分化的最适合条件［16］。

1.2 BM MSCs的体外培养

BM MSCs易分离、纯化，其体外分离方法主要有四种：① 密度梯度离心法。② 贴壁筛选法。③ 流式细胞仪分选法。④ 免疫磁珠分选法。其中贴壁筛选法操作简单，对细胞损伤较少，被广泛应用［18］。

体外培养的BM MSCs体积比较小，核仁明显，培养时贴壁，可聚集成均匀的集落，生长曲线呈“S”型［19］，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95%和98%。细胞的大小、形态和汇合度可以用倒置显微镜来观察。脂肪诱导和成骨诱导可以验证BM MSCs生长效果。脂肪的诱导分化通过油红O染色作为20天后细胞内脂质堆积的指示。成骨的诱导分化用碱性磷酸酶检测14天后诱导效果。茜素红染色作为21天后细胞外基质钙化的指示［20］。

1.3 细胞因子与BM MSCs的关系

细胞因子包括白细胞介素（IL）、干扰素（INF）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、生长因子（GF）和趋化性细胞因子六大类。

BM MSCs分泌有大量的GF，包括成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子等［21］。基质细胞衍生因子 1（SDF-1）/CXCR4轴［22］、PDGF、EGF 及其配体肝素［23-24］可以使调整BM MSCs迁移，使其生存能力和增殖能力显著提高，促进血管生成细胞因子分泌，如碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。Western bloting和实时聚合酶链反应（RT-PCR）显示SDF-1预处理可以激活具有促进生长的苏氨酸激酶和细胞外调节蛋白激酶相关的信号转导通路，上调B细胞淋巴瘤-2/B细胞淋巴瘤相关蛋白的比值。FGF4和HGF通过有丝分裂活化蛋白激酶细胞信号途径（MAPK cell-signing pathway）提高BM MSCs分化成肝细胞的能力［25］。门脉注射人HGF基因修饰的BM MSCs后，免疫排斥反应受到抑制，肝功能显著改善，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4和IL-10水平增加，细胞凋亡水平降低，增殖细胞核抗原的表达水平增加，大鼠生存时间延长。并发现绿色荧光蛋白不会影响BM MSCs的作用［26］。值得注意的是所有细胞因子与BM MSCs的作用都是在具有充分血清营养的前提下发挥的［27］。

2 HBV与BM MSCs之间的作用关系

Ma等［28］第一次发现人BM MSCs能支持挑剔的HBV感染、复制、表达和藏匿，且HBV感染后BM MSCs形态不变。由于病毒基因通过整合或者转染而不是感染进入细胞，所以BM MSCs比Hep G2更适合作为查看HBV生命周期和原始病毒与细胞相互作用机制的工具。BM MSCs用HBV阳性血清培养的1天后，细胞内、外乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV DNA）、乙肝病毒的共价环状闭合脱氧核糖核酸（cccDNA），培养基中乙肝表面抗体（HBsAg）、乙肝核心抗体（HBcAg）、乙肝e抗体（HBeAg）等相继出现，并且发现HBV体外感染 BM MSC 与人初级肝细胞［29］和人肝癌细胞株［30-31］相比，不同的地方在于HBcAg的高表达。结果显示存在于BM MSC中的病毒部分是半径50 ～200 nm的球形。这些病毒成分、HBsAg及HBcAg存在于细胞的细胞质中，提示HBV在细胞中已经发生转录并表达抗原。

HBV抑制BM MSCs的体外扩增，但不会影响BM MSCs的免疫表型、向肝细胞分化并具有肝细胞样作用的能力［32］。Zhong 等［20］收集 15 份来自于慢性乙型肝炎和肝硬化患者的BM MSCs、11份来自于有着同样的年龄结构的健康人的BM MSCs进行体外培养。用RT-PCR分析，BM MSCs及其生存的培养基中均未检测到HBV DNA和mRNA的存在，但细胞上的PDGF-α、PDGF-β、IGF-1和碱性成纤维细胞生长因子表达都减少。排除年龄因素后，GF表达的减少造成患者BM MSCs的增殖减少。需要进一步的研究评估慢性乙型肝炎患者更多的GF和其BM MSCs上细胞因子的多样性。

BM MSCs对HBV有抵抗力，在BM MSCs中检测不到cccDNA基因组和前RNA基因组，提示HBV不能在BM MSCs或内皮祖细胞中复制［33］。Xie等［34］对乙肝患者体外培养至第3、4、5代的BM MSCs进行检测发现，细胞内、外及其培养基中HBV DNA、HBsAg和HBcAg均显示阴性。健康人的BM MSCs及其第6、12、18天诱导的类肝细胞在含有HBV的血清感染环境下培养48小时，大约80%的细胞免于感染。胡维亨和任军［32］观察HBV阳性血清培养的人BM MSCs大约半数以上扩增受阻，但是只有不到5%的细胞可以检测到病毒表达。所以他从这份低病毒表达率上得出结论，BM MSCs对HBV是有抵抗的。

Rong等［33］发现 BM MSCs能吞噬 HBV，帮助它进入受伤的组织中。

3 BM MSCs移植疗法治疗乙肝终末期肝病

BM MSCs是一类免疫缺陷细胞，可以抑制T细胞的增殖和激活，通过可溶性因子的介导来发挥免疫调节功能，实验发现转化生长因子（TGF-β）、前列腺素 E2（PGE2）、吲哚胺双加氧酶（IDO）［35］等因子可能参与BM MSCs的免疫调节，减少免疫排斥反应的发生。

肝硬化是肝病的晚期阶段。而肝硬化的主要病理变化就是肝纤维化。肝纤维化是指细胞外基质（ECM）积累过多和受伤区域的疤痕组织的形成。在受伤的肝脏中，活化的肝星状细胞（HSC）是主要的ECM产生细胞，能够合成大量的细胞基质蛋白。BM MSCs能诱导活化的HSC凋亡而终止肝硬化进展［36］。Mohamadnejad 等［37］治疗4例晚期肝硬化患者，体外培养BM MSCs经肘静脉注射回患者体内。所有患者均无死亡及并发症出现。Sakaida等［38］将自体骨髓细胞移植入用标记着绿色荧光蛋白的四氯化碳（GFP/CCl4）诱导的小鼠肝硬化模型，移植的细胞在损伤的肝组织内有效增殖分化为肝细胞，改善肝脏功能，提高了患病小鼠的生存率。Parekkadan等［39］发现BM MSCs可以分泌多种细胞因子，促进肝细胞增殖及肝脏血管再生，促进免疫细胞增殖并向肝脏迁移，提高了大鼠生存率。Peng等［40］的研究发现乙型肝炎引起的肝衰竭患者自体BM MSCs移植是安全的，短期明显改善肝脏功能，但长期的肝细胞性肝癌发病率或病死率没有显著差异。

自体移植后的排斥反应很弱，可以克服临床上的移植排斥问题。异种移植的免疫反应比自体移植的要强烈些，但也比肝移植的免疫排斥弱得多。而且BM MSCs容易获得，并能在体内广泛分化而不涉及伦理问题，对于肝脏来说以BM MSCs为基础的治疗比其他干细胞都适合。但需注意的是由于BM MSCs能吞噬HBV，帮助它进入受伤的组织中，可能引起乙肝反弹。所以我们不能给有其他组织受伤的乙肝患者进行BM MSCs的移植。

4 总 结

BM MSCs移植是药物治疗和手术治疗之后的又一场医疗革命。病毒性肝炎及其晚期肝硬化、肝癌是严重威胁人类健康的常见病，2004至2012年我国共报告病毒性肝炎发病数13 501 863例，年均发病率为112.960/10万，年均死亡率为1.007/10万，在5种类型肝炎中，乙肝发病数最多，占病毒性肝炎传染病总数的82.125%［41］。因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后的并发症等限制了原位肝移植的广泛应用。所以外源性BM MSCs移植将成为未来的新兴的治疗方法。不过要实现将BM MSCs移植应用于临床上，还有很多的关键问题需要解决，例如，如何处理BM MSCs移植后的乙肝再感染问题，BM MSCs感染HBV后的产物能否在人体内获得容许存在下去。BM MSCs转化成肝细胞后，是否表达主要组织相容性抗原，发挥免疫调控［42］。如何保持间充质干细胞经过体外大规模培养后的分化能力、遗传特征、致瘤性和稳定性；如何建立干细胞产品的技术标准及质量评价体系等等。另外，建立健全规范的法律法规和统一的生产和质量标准也是发展间充质干细胞技术的关键。只有通过严格的临床试验审查，才能防止损害公众利益的事情发生。