结核病实验室诊断技术研究进展

董玉霞 闫宝环 彭景丽 鲍云波 沈颜红

结核病是一个全球性的重要的公共卫生问题，根据WHO统计，每年全球约300万人死于结核病。尤其是在最近十年，结核病在全球疫情又呈上升趋势，对一些国家已构成严重的健康威胁。因此，找到一种快速、特异的诊断方法，以控制结核病的传播具有重要的意义。近年来随着对结核病的研究的不断深入和科学技术的不断进步，实验室诊断技包括细菌学、血清免疫学和分子生物学三个方面有了很大的进展，综述如下。

1 细菌学检测方法

结核分枝杆菌的检测是病原学诊断的可靠标准，并且可作为判断结核病治疗疗效、结核活动的主要指标。传统的涂片镜检法、改良罗氏培养法等检测方法虽然设备简单、费用低廉等优点，但往往有检出率低，周期长等局限性［1］。在近十多年以来，针对结核分枝杆菌的特性，建立了一系列快速检测系统。

1.1 Bactec检测系统(包括460TBBactec、BACTEC MGIT 960TB、MB/BacTec)460TBBactec方法阳性率约为80%，比传统的改良罗氏培养法(L-J法)明显提高;检测时间约9～14 d，明显比 L-J法缩短［2］。但是因底物有放射性，易污染环境，且设备价格昂贵，不宜推广。

BACTEC MGIT 960系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。Rishi等［3-5］的研究结果显示，该方法较固体培养法L-J法缩短了诊断时间并提高了诊断的敏感性。MB/BacTec系统是和BACTECMGIT 960系统相同，是应用液体培养的系统，此系统对标本中结核分枝杆菌复合群进行分离，和BACTEC-460系统相比，在肉眼下可看到结核杆菌生长，初分离率明显提高，并且无放射污染，但是缺点是不能作菌型鉴定［6，7］。

1.2 噬菌体扩增法和噬菌体生物发光检测 菌体扩增法是近年来新出现的用于检测结核分枝杆菌中活菌的快速诊断方法，原理是:噬菌体在适宜条件下侵入标本中活的结核杆菌体内，在菌体内进行增殖，游离的噬菌体以噬菌体杀灭剂杀死，此时加入快生长分枝杆菌，此时侵入细菌体内的噬菌体大量繁殖，释放出来，使结核杆菌指示细胞被感染、破坏、裂解，在电泳琼脂版会出现噬菌斑。正常情况下，被加入噬菌体灭活剂后，因无噬菌体破坏指示细胞，使指示细胞在琼脂版上均匀生长。据噬菌斑出现情况，判断有无活菌生长，该方法灵敏度高，且不需要高致病菌的结核分枝杆菌和特殊设备，可用于快速检测活的结核杆菌。贺瑜［8］应用此方法检测结核分枝杆菌进行流行病学调查，赵庆华等［9］采用噬菌体法和涂片法比较观察269例住院肺结核患者疗效，噬菌体法检测结核分枝杆菌阳性57例，阴性212例;涂片法阳性60例，阴性209例。并且弥补了涂片法不能检测死菌活菌的不足。

噬菌体生物发光法检测原理:在分枝杆菌噬菌体中插入虫荧光素酶的基因Efflux重组噬菌体，在大量噬菌体在标本中获得结核分枝杆菌内繁殖时，因重组的噬菌体内的虫荧光素酶在体外与冲荧光素混合后，二者作用而发出荧光，发光强度以荧光素没含量成正比，检测发光强度经幸噬菌体的定性定量分析，再以噬菌体量测定结核分支杆菌含量。此方法较直观，但是必须使用标准化培养基和发光仪，并要求与常规检测的最低抑菌浓度值一致。熊瑜等［10］收集89份糖尿病合并结核感染患者的痰、支气管镜镜抽取液标，应用噬菌体生物扩增法检测结核分支杆菌，同时作抗酸染色、并用VersaTREKTM细菌培养仪做分支杆菌培养。噬菌体生物扩增法和/或培养阳性的菌株32株做分支杆菌菌种鉴定。噬菌体生物扩增法检测结核分支杆菌快速、特异、敏感，在糖尿病合并结核感染的快速诊断中有重要价值。

2 血清免疫学检测方法

研究表明，结核病患者体液免疫反应中特异性抗体水平明显升高，因此可通过检测患者血清中特异性抗体，鉴别疾病是否处于活动期，但是结核病中抗原多且复杂，因个体的免疫背景和疾病发展不同而异，可出现不同的抗体图谱。

2.1 酶联免疫吸附法(ELISA)LISA原理:在加入抗原或抗体吸附致固体的载体模板上，使标本与酶结合物反应，利用酶催化反应产生底物的呈色，检测抗体或抗原的方法。ELISA法检测是应用血清免疫学检测患者患肺外结核的重要方法之一，在结核病血清学诊断方面研究最多、应用最广［11，12］。但总的来说其方法还不够成熟，检测使用的抗原不同(菌种不同、纯化程度不同、抗原成分不同)、观察对象、病程不同，导致其结果差异很大，敏感性及特异性尚不够稳定。Kashyap等［13］采用间接ELISA方法，应用Ag85复合物的单克隆抗体检测血清标本中该抗原。阳幼荣等［14］应用ELISA方法测定结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原，提高了其免疫学检测的敏感性和特异性。

2.2 T-SPOT-TB试验 以特异性抗原为刺激源，应用酶联免疫斑点技术诊断结核感染的新方法。项杰等［15］据结核感染后体内存在抗原特异性的记忆性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，迅速活化增值，释放干扰素的原理，建立了以RDI编码的结核特异性抗原6kD早期分泌靶向抗原(ES-AT-6)和10Kd培养滤过蛋白肽段库为刺激源，检测外周血中释放结核特异性干扰素的T细胞，据此诊断结核感染。优点是实验结果清晰，易判断，综合敏感性较高，在免疫低下人群中、肺外结核的诊断中能维持较高敏感性［16］。另 TSPOT-TB能够准确锁定需预防性抗结核治疗的感染者，斑点越多发生活动性结核的可能性越大，短期内半点明显增多，提示体内结核活动［17］，因此对于预防性治疗十分必要。

2.3 结明(Myco DotTM)实验 结明(Myco DotTM)实验即结明三项(18KDa、16 KDa、LAM)，是国内外使用较早、较普遍的结核抗体快速检测方法。最早仅检测LAM，以后发展为三项。原理:把含有抗原的电泳梳放入被检测的血清中，如标本中含有抗体，则抗原抗体结合，在把已结合抗原抗体的电泳梳，置于显色液中，梳上附着抗原的部位就会出现红色斑点，即为阳性。结核杆菌细胞壁上含有阿拉伯甘露糖，当有结核病活动时，会呈现阳性红斑，而既往曾患结核病者或卡介苗接种后、健康人不会出现红斑，但是因试剂为进口试剂价格昂贵，难广泛开展。

2.4 γ-干扰素释放试验 受检者全血或外周血中单核细胞(PBMC)，在特异或非特异抗原在体外刺激下，T淋巴细胞产生大量IFN-γ，用酶联免疫斑点技术或酶联免疫吸附法检测IFN-γ血中的浓度或应用计数分泌IFN-γ细胞的方法。目前该方法已经在日本、英国、美国等地用于潜伏期肺结核和活动性肺结核感染者的诊断［18］。目前在临床上不能准确判断卡介苗接种TST阳性结果，或TST阴性临床结合病史影像学检查不能排除结核病存在时，γ-干扰素释放试验可作为一项重要的辅助诊断检查，但是价格昂贵，基层不易开展。

3 分子生物学检测方法

3.1 聚合酶链反应(PCR)技术 近二十年来，已经有很多种PCR技术用于检测结核分枝杆菌插入序列［19，20］。Elbir等［21］报道了一种简单、快捷并且敏感的PCR序列，行PCR检测前不需做DNA纯化，直接把PCR反应的混合物直接加入乙醇，应用IS6110插入序列，检测了44种标本，全部阳性，简化了试验步骤，降低操作难度，敏感度特异性较高，是一种简便快捷的基因检测技术。尤其对于菌量少，有变异的易被常规细菌学检测方法漏诊的病人，进行早期诊断、鉴别诊断，观察治疗疗效，有重要临床价值。PCR技术不足之处是易受外界同源DNA污染，非特异性扩增出现假阳性结果，而由于细胞壁破环不彻底，或PCR抑制物存在，致出现假阴性结果，因此应用PCR检测应结合临床症状及其他辅助检查，综合分析以便明确诊断。

3.2 巢式 PCR技术 与普通PCR技术比较，巢式PCR技术有进一步发展，应用两对引物扩增完整的DNA序列，一对为PCR的引物，另一对为巢式引物。原理是第二对引物结合于第一对引物的内部，使第二次扩增的产物较短，从而使扩增结果特异性更强。相对来说液体标本巢式PCR检测率更高，特异性更强，普通PCR和巢式PCR两种检测方法发现巢式技术灵敏度、特异度较高。比较巢式PCR与抗酸染色两种方法对可疑结核的固体石蜡组织检测，发现此方法可提高检出率。Schulz等［22］对190例中119例分枝杆菌DNA检测阳性，其中71例符合典型结核杆菌;41例发现不典型分枝杆菌DNA。Azov等［23］应用此方法检测46例石蜡切片，对于抗酸染色法明确诊断的结核病例，灵敏度100%，尤其对结核杆菌复合群和鸟型分枝杆菌有特异性。对于不典型的肉芽肿性病例，该方法明确诊断9例，其中4例符合不典型结核杆菌。由此说明巢式PCR对于石蜡组织的结核杆菌检测有重要意义。

3.3 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术 实时荧光定量，同时具有引物和探针的两种特异性，对于细菌学检测的特异性有明显提高，自动完成Southern印记杂交，可提高基因的特异性。Pinsky等［24］介绍应用多重实时荧光定量PCR方法鉴定牛分枝杆菌、人型结核分枝杆菌及卡介苗。检测60例标本中，57例为人型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌，3例为卡介苗接种。Chang等［25］实时荧光定量PCR方法进行了人型结核杆菌和牛型结核杆菌鉴定。Takahashi等［26，27］对此方法和巢式技术进行比较，该方法吸收了巢式技术的优点，避免了巢式PCR技术易受污染的缺点。尽管Real-Time PCR技术在结核分枝杆菌检测方面有许多优势，但由于其高灵敏性、实验操作易受污染等而容易出现假阳性。但是实时荧光定量方法易出现假阳性结果，不能仅此方法作为诊断依据，只有具有一定数量时才有临床意义。

3.4 限制性片段长度多态性PCR检测技术 PCRRFLP是在PCR技术的基础上，限制性内切酶联合鉴定技术综合分析，鉴定分枝杆菌菌种的可靠方法。因此较常规方法更准确、快速。Agacayak等［28］通应用限制性内切酶技术检测65kD蛋白基因的PCR产物进行分析，发现能够检测出结核分枝杆菌属种。Caws等［29］利用该技术进行了耐异烟肼的结核菌中含KatG-315突变体。此突变体可保护结核菌不被异烟肼杀灭，使结核菌毒力增强，应用此方法可检出耐药菌，提高药敏试验敏感性。Yzquierdo等［30］应用PCR方法循环扩增Hsp65基因片段，再用RFLP消化此基因片段，检测是否存在结核杆菌感染。该检测方法检测的关键在于内切酶和引物的选择［31］。

3.5 基因芯片技术(Gene Chips) 基因芯片是，以微孔滤膜为载体，利用微阵列技术将三种抗原18 kDa、16 kDa、LAM固定于同一膜片上，利用微孔滤膜的渗透、浓集作用，抗原抗体在固相膜上快速反应，生成免疫复合物，用免疫金作标记，待膜显色，把显色的芯片进行不通抗原点阵灰度值分析，检测出结核分枝杆菌。应用高密度寡核苷酸序列通过利用rpoB基因的保守片段与探针基因芯片杂交，进行了耐利福平突变基因rpoB的检测。第一块结核病的基因芯片，包括2部分，其中一部分用于耐利福平菌株中rpoB基因的检测，部分是在结核分枝杆菌有种间多态性的16SrRNA基因片段，可鉴别结核分支和非分枝杆菌。基因芯片检测法最大的优势在于能够同时分析成千上万个基因。进一步利用DNA芯片分别检测耐异烟肼菌株和耐利福平菌株，敏感度分别为95%和80%。段慧萍等［32］应用结核蛋白芯片检测 18 kDa、16 kDa、LAM 三种结核抗体，三种抗体联合检测对于结核菌感染血清学诊断有很高灵敏度和特异性结果有芯片阅读仪完成，避免认为主观误差的优点。基因芯片在结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测、基因组比较分析等方面发挥着重要的作用，但由于仪器昂贵和制备芯片成本偏高等因素，限制了其在基层单位的应用。

综上所述，近年来结核病的实验室诊断在多方面有了很大的进展，但由于结核杆菌变异较大，且具有多样性，同时由于应用抗结核药物的不规范性，不能足量足疗程正规治疗，出现多种耐药菌，耐多药菌株，单一方法往往不能鉴定出所有结核杆菌，需多种方法联合。多种实验诊断技术由实验室向临床应用的过度，但仍存在很多问题，比如许多实验试剂设备价格昂贵，操作复杂不易在基层推广使用。但是分子生物学技术随着基因诊断发展，对结核杆菌遗传信息的不断发展，为快速诊断结核分枝杆菌提供了更快捷、更敏感的手段，在诊断技术领域拥有巨大的潜力，随着技术的发展，结核病的诊断也将不断完善和发展。

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