蜜蜂白垩病的研究进展

赵红霞，梁 勤，罗岳雄，李江红，张学锋，曾鑫年

(1.广东省昆虫研究所，广州 510260;2.华南农业大学，广州 510642;3.福建农林大学，福州 350002)

蜜蜂白垩病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis 萌发的菌丝侵入蜜蜂幼虫中肠围食膜引起的真菌性传染病。我国饲养西方蜜蜂的蜂群达750 万群，白垩病是影响我国养蜂业发展的潜在病害之一。人类活动范围扩大和交流频繁，西方蜜蜂蜂群几乎遍布世界各地，人们对蜂产品需求的增加，过度索取蜂产品，导致蜜蜂抗逆性降低，直接影响该病的爆发。

随着蜜蜂白垩病作为第一个内生真菌完成了基因组的测序工作(Qin et al.，2006)，蜜蜂白垩病逐渐从分子机制层开展了研究，这将有助于深入探讨球囊菌病原学，便于更好的防控该病。本文就蜜蜂白垩病的研究现状，分别从该病的发生分布范围、分类学、流行病学、发病机理、蜜蜂的免疫反应、生物防治等方面进行综述。

1 蜜蜂白垩病的发生及其分布情况

早在1900年，人们就开始认识到蜜蜂白垩病的发生。1901年，Odier 描述过白垩病的发病情况;1911年Priess 在德国汉诺威省的患病蜂群的巢脾中发现过该病，当地养蜂者将该病称为“白垩病”;1913年德国的科学家对白垩病的发生进行简单阐述(Maassen，1913);接着波兰、法国、前苏联、捷克斯洛伐克等国家先后报道过该病;1930年英国首次报道了白垩病的发生;1955年美国鉴定出致病微生物是一种真菌。此病在1963年以前主要发生在欧洲各国，因患病蜂群少损失小而被列为次要病害。

直到1970年以后迅速传播至美国、加拿大、日本、阿根廷、菲律宾等国(Hitchcock and Christensen，1972)。1969-1975年，相继在加利福尼亚(Hitchcock and Christensen，1972)、亚利桑那州、内布拉斯加州、怀俄明州等(Gilliam，1978)发现该病并严重阻碍蜂业发展。与此同时，在加拿大的中西部地区白垩病发生流行危害(Hitchcock and Christensen，1972)。

1987年之前，地中海国家并未见报道过蜜蜂白垩病发生流行，虽然有些国家蜂群中发生过该病，例如1984年，以色列发现过白垩病，但其发病率较低，并未引起关注(Yacbson et al.，1991)。1988年，白垩病在土耳其蜂蜜主产区规模爆发，危害及其严重。调查显示1986-1988年间主要通过蜂蜡出口，将白垩病传播至其他国家(Tutkun et al.，1993)。1990年，白垩病感染的蜂群数量逐渐增多(Yacobson et al.，1991)。

澳洲地区蜜蜂白垩病的发生流行比较晚，直到1993年白垩病首次在澳大利亚昆士兰地区发生流行，然后传播至整个澳洲地区(Hornitzky，2001)。蜜蜂白垩病在澳洲与北美的迅速传播归咎于商业养蜂的转地饲养。

中国大陆于1961年曾报道发生类似蜜蜂白垩病的病害(陈淑静等，1994)，但仅是零星蜂场、个别蜂群染病，未造成危害，故而未受到重视。1983年，我国台湾省三峡地区首次发生蜜蜂白垩病，由于该时期正处于转地放蜂时期，于是此病很快蔓延至台湾全省，成为台湾地区蜜蜂主要病害。1991年中国大陆江苏扬州、浙江宁波等地出现蜜蜂白垩病;直到1992年暴发流行，并且扩散至十多个省区，至1993年已遍及全国所有的蜜蜂饲养区。1992-1993年全国的意大利蜜蜂蜂群发病率达30%-40%，其中四川、浙江、江苏、安徽等重病区的蜂群发病率高达50%-60%，严重地影响养蜂业的发展。1996年以来，蜜蜂白垩病的发病率总体虽呈下降趋势，但在部分地区仍然很严重(Zaghloul et al.，2005)，仍是影响当地养蜂业发展的主要病害。2005年5月，中华人民共和国农业部第53 号令公布的《动物病原微生物分类名录》也将白垩病蜂球囊菌定为三类动物病原微生物。

2 分类学

球囊菌属中包含一些腐生生物和一些病原微生物。迄今为止，已经鉴定出球囊菌属的22个种，它们以致病性真菌或腐生菌存在于蜜蜂体内(Hibbett et al.，2007)。先前仅仅依靠形态学，很难对球囊菌进行分类。近年来，随着分子生物学的发展，一些分子生物学技术被用于球囊菌的分类和鉴定，并取得了成功。Reynaldi 等(2003)利用同工酶技术，成功将蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis与同属 Ascosphaera proliperda、Ascosphaera aggregata 区分开。

Hassan 等(1985)用Rep-PCR 方法鉴定不同的蜜蜂球囊菌菌株，但是这种方法需要纯化蜜蜂球囊菌。James 等(2006)根据球囊菌属核糖体保守序列设计不同引物，进行PCR 扩增，成功将球囊菌属和与之最相近的属区分开来。此方法不但有很高的灵敏性，而且可以鉴定各个种的混合感染。目前，采用DNA 技术将蜜蜂白垩病的病原物归为子囊菌门 Ascomycota、子囊菌亚门Pezizomycotina、散囊菌纲Eurotiomycetes、散囊菌亚纲Eurotiomycetidae、散囊菌目Onygenales、子囊球菌科 Ascosphaeraceae、囊球菌属 Ascosphaera(Lumbsch and Huhndorf，2007)。

3 流行病学

在春季，白垩病是西方蜜蜂主要病害之一，真菌极易于冷热交替和高湿度(通风差)的环境中繁殖(Borum and Ulgen，2008)。除了环境因素，诸如真菌的菌株特点和蜜蜂的遗传背景等生物因子也影响该病的发病率和病害的严重性。关于真菌菌株，不同球囊菌的品系侵染差异达20 倍(Glinski，2003)，高浓度的真菌孢子增加了感染机率(Gilliam et al.，1988;Flores et al.，2005a;2005b)。在蜂群中，白垩病发病的速度取决于特定的球囊菌品系、球囊菌孢子萌发的速度和孢子扩散的有效性。

蜜蜂的遗传背景、健康状况和压力都是影响白垩病发生的重要因子，因此，许多研究通过选择性育种技术，改善蜜蜂的品系，达到耐受白垩病的目的(Gilliam et al.，1983;Spivak and Reuter，1998a;1998b)。由于预先存在的压力，诸如生物和非生物因子都削弱了蜜蜂先天性免疫反应，导致易受病害危害(Flores et al.，1996;Bailey，1981)。防治白垩病最重要的是改进饲养管理策略。

4 发病机理

两性孢子最初被认为是幼虫染病的主要因子(Spiltoir，1955;Hitchcock and Christensen，1972;Rose et al.，1984)。早期的研究得出孢子首先侵染幼虫表皮，然后被摄取吸收(Matus and Sarbak，1974;Gilliam et al.，1978)。现在广泛认为球囊菌孢子被幼虫消化吸收致其发病(Flores et al.，1996;Heath，1982)。球囊菌可以感染三型蜂(工蜂，雄蜂和蜂王)的幼虫。根据Bailey(1963，1981)报道，3-4 日龄幼虫易被感染，而其他研究者发现1-2 日龄幼虫也容易感染(De，1976)。郑志阳等(2010)证实室内饲养的蜜蜂幼虫，菌丝均在幼虫7 日龄末至8 日龄从幼虫末端穿出体表。成年蜜蜂虽然不受球囊菌危害，但是在病原物的传播中起着媒介作用;成年蜜蜂间通过互哺行为导致病原物的传递;采集蜂携带真菌孢子的蜜源食物返回巢内，然后被孢子感染的食物通过哺育幼虫的过程传递，致其幼虫发病(Gilliam and Vandenberg，1997)。蜂箱或巢框等蜂机具中蜜蜂球囊孢子至少可以存活15年，因此，这类蜂机具可能作为白垩病发生流行的源头(Anderson，1997)。

蜜蜂幼虫通过肠道内的CO2，促进球囊菌孢子的萌发。幼虫被球囊菌感染后，快速减少消耗食物，最后停止取食。Theantana and Chantawannakul(2008)证实，球囊菌产生的胞外酶辅助其侵染幼虫中肠围食膜。球囊菌侵入中肠肠壁后，菌丝开始进入体腔生长，甚至侵入幼虫后肠(Koenig，1987;Nelson and Gochnauer，1982)。蜜蜂球囊菌从幼虫体后生成并逐渐覆盖整个幼虫。然后，球囊菌菌丝生长变为棕色或黑色孢子，改变了菌丝的大小和颜色，这种变化形式是由于球囊菌子实体的生成。蜜蜂幼虫的死亡源于机械损伤、酶活性改变、血淋巴循环的破坏和毒性的产生等原因(Glinski et al.，2003)。

从表观症状观察球囊菌感染蜜蜂幼虫体的变化过程，首先幼虫直立在巢房内，肿胀，微软，后期失水缩小成坚硬的块状物，甚至形成干燥和白垩病干瘪状;而颜色是白色或黑色，均依赖于是否子实体已经出现(Flores et al.，2004)。实验室显微镜观察每个黑色虫体包含108-109个子实体(Hornitzky，2001)，白色虫体未检测到子实体(Hornitzky，2001;Aronstein，unpublished)。

单一交配型菌丝侵染幼虫后，形成了白色虫体(Davis，2003);单一交配型菌丝并未显示感染性且不能产生无性孢子。最初采用白色虫尸分离纯化培养真菌，在培养的过程中分离形成子囊孢子(Aronstein，unpublished)。假设球囊菌的一个交配类型抑制了另外一个交配类型或者两种交配类型不等量分布在环境中，幼虫被侵染后形成白色虫体，一般两种相反的类型不会同时出现在实验室内;所以在自然环境中，不同交配类型产生差异的侵染行为(Christensen and Gilliam，1983)。因此，蜜蜂幼虫感染球囊菌后，发病期短形成白色虫体;如果给予足够的时间和适当的条件，白色菌丝最终发展形成球囊菌子实体。

5 蜜蜂免疫防御反应

病原性真菌通过破坏昆虫的主要物理屏障(表皮和围食膜)进行感染(Barr，1975)。但是，蜜蜂的免疫系统协同作用可灭活或杀死侵入的微生物(Hedengren-Olcott et al.，2004)。首先，蜜蜂体外表皮中的化学物质如蜡质和不饱和脂肪酸具有潜在的抗真菌活性(GlinSki，2001);其次，中肠的生化环境提供了防御食源性真菌性病原物的条件;另外，受伤部位快速激起伤口周围的蛋白水解，导致血液凝固形成黑色素凝块，防止伤口处血淋巴的流失。而黑色素的副产物使活性氧释放，具有细胞毒素抗菌的特性(Davis，2008)。当外在的物理屏障破坏后，侵入的真菌将面对各种生理性的细胞层面和体液性免疫防卫(Glinski，2003)。病原侵入后，立即检测到血淋巴中细胞免疫反应，而抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)明显出现滞后性(Govind，2008;Stanley，2009)。吞噬作用和包囊作用属于蜜蜂防御真菌性病害的普遍防卫机制，血细胞直接杀死真菌孢子，而吞噬机制是破坏其他的未知小分子而杀灭真菌孢子(Stroschein-Stevenson et al.，2009)。激活的体液免疫诱导抗菌肽的合成和溶菌酶活性，激活了酚氧化酶系统。

基于果蝇和蚊子模型，探讨昆虫体液免疫的相关机制。果蝇的体液免疫主要有两个信号路径(Evans et al.，2006)。第一个信号路径由真菌和革兰氏阳性菌引起;第二个Relish 信号路径主要由革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌病原引起(Govind，2008;Evans and Spivak，2010);这两个信号路径均能激发脂肪体和血细胞中抗菌肽(AMPs)的合成。许多AMPs可以通过形成气孔杀死或失活侵入的病原菌，同时突变的果蝇显示易受真菌和细菌的危害，因此两个主要信号路径是相互调节相互影响，蜜蜂信号路径中相关物质已经得到验证(Evans et al.，2006)。然而，蜜蜂的微生物识别和信号路径的机制仍然不甚明了。从基因组层面分析，蜜蜂减少的免疫相关因子可能旧咎于单个蜜蜂微生物的防御，然后，存在一些免疫防卫需要基于群体水平发挥作用，如蜂群卫生行为(Evans and Spivak，2010)。

目前，蜜蜂对白垩病免疫防卫的相关分子机制研究相对较少(Aronstein and Saldivar，2005;Aronstein et al.，2006)。在蜜蜂球囊菌、美洲幼虫腐臭病(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)感染5 日龄幼虫后，对蜜蜂体内的3个溶菌酶和几个抗菌肽(天蚕素、抗菌肽和防御素等)的表达进行了研究。结果表明，虽然各种败血症感染快速引发蜜蜂溶菌酶和几个抗菌肽，但未见任何一个反应是由特定病原引起的。Tanji 等(2007)提出真菌侵染的过程中，激活Toll 信号路径和IMD 信号路径的分支c-Jun N-terminal kinases(JNK)路径中各种物质(Davis et al.，2008)，提出两种路径相互作用(Evans and Spivak，2010)。但是对于蜜蜂成蜂群如何识别球囊菌和其他真菌，真菌孢子，从而引发宿主的免疫信号路径，尚需深入地分子机制研究。

6 白垩病的有效防治方法

广泛的化学药物施用控制白垩病的效果，已经得到验证(Davis and Ward，2003)。但是，Hornitzky(2001)试验证实，一些药物并非专一性防治真菌，故而无法有效控制白垩病。近些年来，由于蜂群中施用化学药物，存在药残和耐药性问题，探讨科学有效防控白垩病的措施或手段极为迫切。本文就几个有效和广泛应用的防治方法进行描述，这些方法包括改进蜜蜂的遗传品系、改进管理和蜂场卫生策略及天然产品防治等。

6.1 改进遗传品系

蜜蜂卫生行为指蜜蜂具有侦察监测和移走病虫或被寄生幼虫的行为能力。目前，卫生行为被认为是蜜蜂耐受各种幼虫疾病的主要机制(Spivak and Reuter，2001)。具有卫生行为的蜂群明显减少了储存在食物和巢脾蜂蜡中真菌孢子的数量，使这些蜂群抗白垩病能力大大增强，从而减少了白垩病的发生和化学药物的使用(Lapidge et al.，2002)。鉴于蜂王繁殖的特点，一般通过选育具有卫生行为蜂群的蜂王，进行白垩病预防。

近来的研究，研究者通过控制卫生行为的基因及其相互作用，增加蜜蜂的遗传多样性，减少病害的发生(Tarpy，2003)。另外，卫生行为的遗传基础涉及几个基因和极其复杂的行为方式，并且表明增加了遗传多样性可能是减少白垩病爆发的关键(Goode et al.，2005)。

6.2 科学饲养管理

真菌孢子出现在蜂箱各处，具有长时间活性，是导致不断感染的根源。孢子可能存在于蜜蜂储存的花粉(Heath，1982a)、巢脾(Flores et al.，2005)及散装的蜂蜜中(Anderson et al.，1997;Reynaldi et al.，2003)。20℃或30℃环境条件储存蜂蜜两年，分离出的孢子仍可以保持活性15年。

科学饲养管理和有效卫生措施可以预防蜜蜂免白垩病受感染，这些措施包括辅助饲喂，改进营养，提高蜜蜂的健康状况、保持蜂箱卫生及其通风、使用干净的器皿、每年替换子脾、避免蜂群之间的交互感染，通过尝试不同的消毒方法测定蜂箱的孢子存活率。采用熏蒸消毒的方法处理蜂箱及其蜂具，但并未被广泛的接受(Baggio et al.，2005)。伽马辐照Cobalt-60 可以有效的杀灭旧巢框或蜜蜂巢脾的病菌等，在最佳的辐照水平(10 kGray)对蜂蜡无任何副作用(Wooton et al.，1985)，然而，辐照相关设备价格高不利于该措施的推广和充分利用。采取了一些物理化学措施对蜂蜜处理后，导致酶活性降低，巢框变形或颜色改变。蜂箱加热杀菌后易造成巢框变形。Anderson等(1997)证实对蜂蜜进行65℃水浴8 h 或70℃水浴2 h 后，球囊菌孢子被杀死，90℃以上加热的蜂蜜导致焦糖化，改变了色泽;加热后的蜂蜜羟甲基糠醛的含量增加且酶活降低了，因此，精确控制温度进行蜂蜜杀菌，避免色泽改变。目前的研究集中在微波辐射、红外线加热、超声波降解和超过滤技术等对蜂蜜进行处理，以尽量不影响蜂蜜的质量(Subramanian et al.，2007)。

6.3 采用天然产物和微生物防控白垩病

鉴于白垩病已经传播至世界各地，且防治措施仅限于化学药剂，故而有必要找到可替代的防治方法。天然产物防治将是可供选择的有效真菌制剂。许多天然产物的抗真菌活性已经测定，如尼泊尔的柠檬草油、柠檬香桉树提取油、柠檬香茶树提取油和新西兰卖卢卡树提取油对球囊菌均具有较好的抑制作用(Goettel and Duke，1996)。有机酸和对苯酸甲酯对切叶蜂的白垩病有治疗效果(Martha，1998)。蜂粮(蜂蜜和水混合物)中加入1%天然产物精油对蜂群生长发育和繁殖无影响，却能有效降低白垩病的发病率;天然巢脾内的蜂粮中检测到两种抗霉菌物质，能够抑制蜜蜂球囊菌的生长(Martha and Gilliam，1998)。Reynald 对从蜂蜜中分离的需氧型抑制球囊菌孢子形成的细菌进行了研究(Reynaldi，2004)。此外，广谱抗菌物质(溶菌酶)和实验室培养过程中拮抗真菌也可以用于控制白垩病(Mourad and Zaghloul，2005)。

健康蜜蜂的机体上共生着的一些微生物，不仅可以增强蜜蜂各个方面的生存能力，而且使蜂群免受球囊菌的侵害(Hetru，1998)。细菌或代谢产物对球囊菌生长及产孢量有影响，能明显抑制菌丝生长或产孢(Basin and Gurel，1999;Reynaldi，2003)，诸如一些芽孢杆菌可以抑制球囊菌孢子形成(Wolski et al.，1997)。加拿大已经测定了一些真菌，例如青霉、曲霉、芽孢均可以抑制实验室培养基中蜜蜂球囊菌的生长。

7 展望

蜜蜂白垩病不仅困扰蜂农，而且严重影响养蜂业的经济发展。近些年，蜂农生活压力增加，从蜂群中过度索取蜜蜂产品，引起蜜蜂抗逆抗病性减弱，导致蜜蜂易被新寄生物和病原侵入;使用化学药物防治病虫害，容易造成药物残留和产品品质下降;因此，我们需要科学饲养管理蜂群。在日常饲养管理措施中，卫生蜂王选育和巢脾定期更替有利于防治白垩病，但劳动力和生产成本明显增加;同时，大部分白垩病初期阶段的白色虫尸，并不能进行真菌繁殖;只有当白色菌丝形成子囊体后，才具有强繁殖力，且耐受各种压力和存活时间延长，故而我们需要防止真菌形成子囊体(Aronstein and Murray，2010)。其次，球囊菌与蜜蜂是处于共同进化的过程。我们将来对蜜蜂白垩病的研究目标，就是科学饲养管理蜂群，防止真菌的繁殖，使其处于经济危害水平之下。

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