美国立克次体病的研究现状

林永丽，李旭霞，方旭东

立克次体病属人兽共患的自然疫源性疾病，是立克次体所致疾病的总称。当前，国际反恐已将流行性斑疹伤寒、落矶山斑点热和Q热列入生物战剂目录中［1］。因此，关于立克次体病的疹断和防治等方面的研究越来越受到关注，现就美国立克次体病的研究现状做一概述。

1 疫苗的研究

注射疫苗是目前预防流行病的一种有效措施，因此各国都在积极地进行流行病疫苗的研究。美国海军医学研究中心目前已经鉴定到2种立克次体的疫苗，即56 ku(r56)的重组体抗体和47 ku(HtrA)DNA质粒。并已证实，这2种疫苗具有相同的预防效果，且47 ku抗体的预防范围更为广泛。另外，胚细胞研究发现，47 ku抗体的基因顺序和人类的丝氨酸蛋白酶同源，这或许会给人一些启示。

1.1 47 ku DNA

2007年，美国科学家在研究恙虫热斑疹伤寒疫苗的过程中，将一种 pKarp 47 DNA疫苗应用于 cynomo1gus猴。2008年，临床化学和血液学评价结果显示，这种疫苗对该猴是安全的。此结果与通过肉眼观察猴的行为和一系列活动的结果相一致。而且，通过定量的实时PCR测到的菌血症确定了该疫苗的有效性。与对照组比，5只接种过pKarp 47 DNA疫苗的猴体内均产生了一种抗原特异性抗体反应;其中，有3只患上了菌血症，且患病的时间均有所延迟，症状也较轻;另有2只未患上菌血症，这2只被免疫的猴未显示有精神障碍，但却患上了淋巴结病。

可以确定，pKarp 47是主要的恙虫热斑疹伤寒疫苗之一，它是一种DNA质粒，可表达47 ku的抗体。由于它同人类蛋白水解酶HtrA1具有高度同源性，已引起了科学家对自身免疫反应的极大关注。截去与蛋白水解酶同源部分的47 ku的基因片段(47c、47e、47f)被插入到一个DNA质粒中，通过转染和蛋白印迹分析，可以确定这些片段在哺乳动物细胞中的表达，以此可用来评价这些质粒结构的保护效果。

1.2 r56重组体

新几内亚、日本、缅甸和马来西亚的4种最主要的菌株(Karp，Kato，Gi11iam和TA763)的r56已经有生产。并有研究证实，它们的重组体Karp r56对同源体的保护效果非常好，但对交叉体的保护则很弱。极有可能4种菌株的重组体包含了这4种菌株的大部分成分，故具有非常广泛的保护作用。来自于恙虫TA763菌株的56 ku蛋白抗体已经被成功克隆、表达，并已纯化到了95%的纯度。科学家通过蛋白印迹实验观察了被感染了TA763的鼠的反应，被感染了的大鼠抗体已被进一步通过血清进行了评价，并发现它与另外14种菌株存在着交叉反应。此结果提示，TA763 r56是一种具有较广交叉反应的抗体，可以作为一种能够提供较为广泛预防保护作用的疫苗。初步的结果显示，TA763 r56可以有效保护大鼠免被TA763感染。

美国科学家根据56 ku蛋白(来自于Karp r56和TA763菌株)抗体顺序设计了几个嵌合体抗体，这给类似的广谱的交叉反应提供了任一一个亲本的菌株。因此，用任一一个嵌合体蛋白替代2种蛋白的结合体，也可作为疫苗的选择。实验显示，嵌合体蛋白对保护Karp菌株是非常有效的，但是对保护TA763菌株的效果则较小;然而，用嵌合体蛋白保护TA763菌株则较用Karp r56效果要好，但其中原因科学家还正在研究之中。

2 诊断分析

立克次体的诊断除临床表现及体征外，主要依据实验室诊断。目前，实验室诊断方法包括血清学、病原学和分子生物学。其中，分子生物学诊断技术已广泛应用于立克次体病的诊断中，如采用保守基因设计引物进行各种聚合酶链式反应(po1ymerase chain reaction，PCR)、限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment 1ength po1ymorphism，RFLP)以及基因序列分析等。

2.1 定量聚合酶链式反应和血清学诊断分析

2008年，美国创立了定量聚合酶链式反应(qPCR)分析法来诊断4种立克次体的实验方法，并通过2种血清学分析法进行评价。这4种立克次体分别为Rickettsia slovaca，Rickettsia africae，Rickettsia conorii和 Rickettsia raoultii。2 种抗体监测分析包括对Rickettsia prowazekii和Rickettsia typhi的监测。这6种分析可用于测定在人类临床、法医、研究样本以及节肢动物媒介、脊椎动物宿主样本中的立克次体。

2.2 便携式、适用于战场型诊断分析

美国立克次体的研究人员研制出一种便携式、适用于战场的诊断恙虫热斑疹伤寒的产品，这种产品是通过利用3种恙虫热立克次体蛋白重组体(Kp r56，Kt r56和Gm r56)来进行诊断的。研究人员利用这种方法进行了以下2种立克次体病的诊断:第1种是从焦痂皮肤活组织中检测到的R．parkeri，这是一个来自维吉尼亚低洼区域的军人不小心被感染的蜱叮咬的病例。第2种是从一个来自埃及的发热患者身上检测到的猫立克次体(R．Felis)。研究人员还从远离国防部的人员及其家属身上检测到R．montanensis，R．amblyommii和R．felis。这一报道高度警示了军事人员被立克次体感染的风险。病毒和立克次体病部门(vira1 and rickettsia1 disease department，VRDD)的研究人员正试图通过获得足够的数据来验证可以用FDA510k试剂盒对立克次体属和恙虫属进行监测分析。

2.3 利用重组体抗原进行诊断分析

美国科研人员已经获得了宿主基因(被立克次体感染的人类外周血细胞和单核细胞系－THP－1)的反应特征，并已作为快速、准确地诊断立克次体疾病和Q热的一种方法。

R．typhi(鼠型斑疹伤寒，AN片段，Coxiella burnetii(Q热，Com－1)，Bartonella bacilliformis(Oroya 热，Pap31)的许多重组体抗原将被用于立克次体病特异抗体的检测。来自斑疹伤寒立克次体的OmpB抗原的重组蛋白片段已被纯化并被甲基化。斑疹热型(SFG)立克次体(R．conorii和R．rickettsii)的OmpB和OmpA的完整的ORF已经被克隆。重组体Pap31已被进一步纯化，并被用来检测了300多名患者的血清。已证明，该法具有极强的敏感性和特异性，很有可能会成为一种快速的分析方法。

2.4 Q热诊断分析的重要进展

为了消除在3级生物安全实验室纯化C．burnetii的危险及增加其重现性、稳定性和寿命，美国科学家用适当修改过的重组体抗原替代原始的完整的细胞抗原进行Q热的免疫检测。研究人员用生物素化的山羊抗人体的IgG/IgM以及过氧化物酶聚合酶(streptavidine)，通过ELISA法对2位患者血清的重组体抗原Com－1进行了评估。一位是来自厄瓜多尔的发热患者，一位是来自美国部署在伊拉克的水兵，疑似Q热病例。在这2个病例中，Com－1的表征与C．burnetii的II期完整细胞抗原相同。另外，重组体抗原OmpA和OmpH已经有生产。这些抗原同 Com－1的组合将通过ELISA法进一步评估，并将用于快速色谱诊断法的构建。而且，这种诊断分析方法可能用于血浆、血清及未经处理的全血中的C．burnetii特异性抗体的检测。

3 立克次体的流行病学

美国科学家还评估了蜱在军事人员中传播立克次体疾病的风险。立克次体DNA在流行病学样本中被认为出现在节肢动物、啮齿动物及人类的样本中。在泰国的一名患者体内特有的、蜱传播的斑疹伤寒立克次体特异的qPCR的分析检测到了Rickettsia honei的DNA。科学家优化了R．montanensis和R．amblyommii-特异的qPCR，以此来确定这些因子是否存在于从军事健康中心的患者身上收集到的蜱(Dermacentor variabilis，Ixodes scapularis和Amblyomma americanum)。这一方法成功地确定了R．montanensis和R．amblyommii存在于被检测的蜱中。

已有科学家对世界范围内军事人员和地方人员患立克次体病的风险进行评估。首先是来自乔治亚州立克次体的评估。在乔治亚州收集的立克次体被作为一种标志确定下来，并被确定为阳性，为立克次体属，科学家通过qPCR基因特异性分析确定为Rick17;另外，TBrick是一种对蜱传播的立克次体的特殊的分析方法。美国科学家近年用此法对来自于蜱的核酸制品进行了分析鉴定，研究结果提示，美国部署在日韩两国的军事人员在鼠类和恙虫热斑疹伤寒方面的感染率低于0.1%。但令人吃惊的是，美国布署在韩国的军事人员感染斑疹热型立克次体的实际风险较高(2%血清转化，浓度提高了4倍)。

4 其他

4.1 试剂储存程序

美国海军医学研究中心拥有世界上最大的立克次体收集渠道之一。这里可以提供qPCR的引物、探针以及qPCR分析的标准和试剂，2个重组蛋白体(如Kp r56)和基于培养物的完整的细胞抗原，为全世界的实验室、SBIR承包商以及国家安全委员会提供血清学分析和分子检测。

4.2 基因组学

美国已在实验室组装了2个Orientia tsutsugamushi(Karp strain)的基因组支架。一个是2.0 Mb，另一个是0.89 Mb。基因组的顺序有90%以上是完整的，而且显示出O．tsutsugamushi在这一领域有不为科学家所知的许多特性。

4.3 蛋白组学

2D凝胶电泳和活细胞－质谱仪/质谱仪的联合应用已证实斑疹热型立克次体(SFGRickettsiae)主要外膜蛋白的翻译后修饰的存在，这对进一步研制出更好的诊断试剂将有所帮助。

［1］ 范明远，栾明春.新发现的立克次体［J］.中华流行病学杂志，2006，27(5):445－447.

［1］ OPNAVINST 5750－12J.OPNAV Report Symbo1 5750－1［R］.Command Seria1 Number:025/1089.Date Submitted:28 February，2009:60－65.