高压稀氧环境下微生物降解甲烷的实验研究

张瑞林,蔡传辉,王振江

(1. 河南工程学院，河南 郑州 451191; 2.河南理工大学，河南 焦作 454003)

近年来，无论是在生物领域，还是其在环境工程、工业工程方面的应用，国内外大量的学者都对甲烷氧化菌开展了广泛、全面的研究。从分布范围讲，甲烷氧化菌分布广泛，在冰原冻土层、垃圾填埋场、水稻田、煤矿土壤等处均有甲烷氧化菌的生存[1-3]；从群落关系看，一般都是多种群甲烷氧化菌群落混合共生，同时还伴有产甲烷细菌等，而且这些群落随着季节、自然环境的改变也会发生变化[4-5]；从生长条件看，因不同自然环境中物质分布不同，不同的甲烷、氧气浓度，以及氨气、化肥、矿井中有毒有害气体、不同氧化底物对其生长可能都有所影响[6]。甲烷氧化菌可应用于环境和工业工程的多个方面，我们重点关注两个方面的应用及潜在价值，即甲烷去除和有毒化合物的生物降解，对源自垃圾填埋场的甲烷气体的去除已经进行了广泛的研究，且其中大部分工作都可以作为矿井瓦斯消除的参考[7]。

随着微生物技术的发展，甲烷氧化菌应用于瓦斯消除已初见成效。俄罗斯研究人员研发了一种甲烷氧化细菌液态“菌剂”，将该菌剂由钻孔注入煤层，在工业化试验中可使甲烷含量降低30%～60%[8]。加拿大学者查克拉沃蒂在模拟试验中观测了不同条件下甲烷氧化细菌氧化甲烷情况，结果表明经细菌处理后甲烷浓度呈10倍甚至100倍降低[9]。北京科技大学的陈东科等在试验中向原煤样添加甲烷氧化细菌，研究发现煤样中瓦斯的平均降解率为44%，最大达52%[10]。

研究结果表明在常压、足氧条件下通过甲烷氧化菌降解甲烷气体具有极大的可行性。若能在采掘作业之前，通过煤层钻孔和高压水将甲烷氧化菌液注入高瓦斯(突出)煤体，把煤层中的瓦斯气体氧化分解成为二氧化碳和水，则可以有效降低煤层瓦斯含量和瓦斯压力，并显著减少采掘期间的瓦斯涌出量。不仅开辟了一条微生物化学方法治理煤矿瓦斯突出、瓦斯爆炸重大灾害的新途径，还能大幅度降低由于大量甲烷排放引起的温室效应，起到煤矿减灾与大气环境保护的双重功效。基于此，本实验设计了多组平行试验，以瓦斯压力、细菌数量、氧浓度为变量，探索高压稀氧环境下甲烷氧化菌降解瓦斯的作用效果，为进一步深入研究和应用提供了可靠依据。

1 甲烷氧化细菌降解CH4机理

甲烷氧化细菌(Methanotrophs)是指能以甲烷为唯一碳源和能源生长的微生物。研究发现其利用CH4的过程如图1所示[11]。

图1 甲烷氧化细菌降解CH4过程

2 实验方法及材料

2.1 实验材料和设备

本实验所用的甲烷氧化细菌菌液由河南师范大学生命科学学院培养，来源于新乡牧野湖旁5～10cm处湿土，采用无机盐无碳源培养基，使用甲烷作为唯一碳源，经过多次分离纯化，革兰氏染色、生长曲线测定等鉴定手段筛选而得，然后将所得菌株培养至7天(进入生长峰值)时的菌液作为实验所用菌液，OD值约为0.8，稀释2倍、3倍后得到不同浓度菌液。

本实验煤样采自河南省焦作市演马矿一工作面钻芯煤粉，晾干后制成直径0.18～0.25mm(60～80孔目)的煤样，约2000g，装入试样瓶中备用。

本实验采用的装置如图2所示，主要分为四个部分，气源：CH4和O2高压气体钢瓶；自制混气系统：两个罐可定量充入、放出单一或混合气体；吸附-降解系统：包括真空泵、吸附罐、恒温水浴系、真空脱气装置等；分析系统：气相色谱仪。

图2 实验装置图

2.2 实验方法

本试验主要过程包括装样—充气—吸附—放气分析—计算。装样：精确称取干燥煤样80g，向煤样里均匀洒入一定体积的菌液，装入煤样吸附罐，抽真空(10min)；充气：先将钢瓶内气体充入混气装置，再将混气装置内的气体作为吸附罐的充气源，控制初始和结束压力可定量，且可以按比例充入CH4和O2混合气体；吸附与降解：充气完成后将吸附罐置于30℃恒温水浴，让煤样吸附瓦斯、甲烷氧化菌降解瓦斯同步进行，观察记录直至压力表恒定；放气分析：分三步，达到吸附平衡后将吸附罐连接上真空脱气装置放气直至常压，由真空液柱下降的刻度读出放气体积，然后通入气相色谱仪分析此时气体组分；再将吸附罐进行高温加热再次进行放气，读出放气体积和进行组分分析；最后将煤样取出密闭粉碎，测定残存在煤样里的CH4与CO2体积；计算：根据各个阶段的压力、放出气体体积，计算气体中CO2含量、煤对CH4的吸附量，分别见图3、图4。

图3 1～4组最终得到CO2总体积

图4 1～4组煤样CH4吸附量

本次实验分别以初始吸附压力、菌液浓度和充气O2浓度为变量，每个变量条件下做三组平行对照试验，探讨了不同条件下甲烷氧化菌降解瓦斯效果以及对煤体吸附瓦斯性能的影响。1号组为压力变量组，向煤样中加入10mL 50%浓度甲烷氧化菌菌液，充入气体CH4：O2为9∶1，初始压力分别控制为5MPa、4MPa、3MPa；2号组为菌液体积变量组，充入气体CH4：O2为9∶1，初始压力控制为4MPa，分别向各组煤样加入10mL 33%、50%、100%浓度的甲烷氧化菌菌液；3号组为O2浓度变量组，向煤样中加入10mL 50%浓度甲烷氧化菌菌液，初始压力控制为4MPa，各组煤样充入吸附气体O2浓度分别为5%、10%、15%。并设置空白对照组4，O2浓度为10%，初始压力分别控制为5MPa、4MPa、3MPa，加入蒸馏水体积为10mL。

3 实验结果及分析

3.1 煤样中CO2生成量的变化

由图3可知，同空白对照组4相比，1～3组所得到的CO2体积均有所增加，这些增加的部分，正是由于甲烷氧化菌的生命呼吸作用产生的。实验表明，在高压稀氧的环境下，甲烷氧化菌仍然能够进行生命呼吸活动，将煤体中的部分CH4氧化成CO2，发挥降解瓦斯和降低瓦斯压力的作用。同时，压力组组1数据表明在较高的环境压力(或较多的反应气体)下生成更多CO2；菌液浓度组组2数据表明更高的细菌浓度能生成更多CO2；O2浓度组组3数据表明更高的O2浓度条件下，甲烷氧化菌可以更好地降解CH4并生成CO2；在O2浓度仅为5%、压力为4MPa的恶劣条件下，反应仍能进行。

3.2 煤样中CH4吸附量的变化

由图4可知，压力变量组组1与空白对照组组4对比，在其他条件相同时，加入甲烷氧化细菌的煤样甲烷吸附量要低于加入等体积蒸馏水的煤样甲烷吸附量。这一结果的产生，正是由于加入了甲烷氧化细菌后降解反应的进行消耗了CH4，生成了CO2，吸附压力的降低和吸附竞争的形成都有利于煤样中吸附瓦斯的解吸。同时由组2和3数据可以看出，菌液浓度的增加和O2浓度的提高都有利于解吸过程的进行，这为今后将甲烷氧化细菌应用于矿井瓦斯防治提供了理论依据。

4 结论及展望

1)实验研究证实，由河南师范大学生物工程学院培育的甲烷氧化菌能降解CH4，降解过程有CO2生成，且在较高压力、氧气浓度较低的情况下仍能发挥作用，但降解效率有待提高，可以考虑通过生物技术和混合菌种群落共生来提高活性和氧化效率。

2)本次实验中，初始压力越高、加入菌液浓度越大、气体中O2含量越高，则越可以更好地促进反应，生成更多的CO2；加入菌液后煤样对CH4的吸附性能降低，更有利于吸附CH4的解吸。结合这两点条件可以设计下一步实验方案，探究如何将甲烷氧化细菌更好地应用到矿井瓦斯防治与环境保护中。

3)甲烷氧化菌降解反应对煤体内吸附瓦斯的影响是多方面的，同时对于瓦斯防治也是有利的，要综合水分、压力、气体成分加以考虑。需要进一步了解降解反应过程及其产物，探究它们的实际作用效果，为甲烷氧化细菌防治瓦斯的走向应用提供更好的理论支撑。

[1] Marina V. Omelchenko, Leana V. Vasilyeva, G.A.Zavarzin. Psychrophilic Methanotroph from Tundra Soil [J]. Current Microbiology, 1993, 27: 255-259.

[2] Barlaz MA, Green RB, Chanton JP, et al. Evaluation of a biologically active cover for mitigation of landfill gas emissions [J]. Environ Sci Technol, 2004, 38(18):4891-4899.

[3] Bing Han, Yin Chen, Guy Abell, et al. Diversity and activity of methanotrophs in alkaline soil from a Chinese coalmine [J].FEMS Microbiol Ecol, 2009, 70：196-207.

[4] CF. Shen, C.B. Miguez, D. Bourque, et al. Methantroph and methanogen coupling in granular biofilm under O2-limited conditions [J]. Biotechnology Letters, 1996, 18(5): 495-500.

[5] P. Vishwakarma, M. Singh, S. K. Dubey. Changes in methanotrophic community composition after rice crop harvest in tropical soils [J]. Biology and Fertility of Soils, 2010, 46(5): 471-479.

[6] Sheeja Jagadevan, Jeremy D. Semrau. Priority pollutant degradation by the facultative methanotroph, Methylocystis strain SB2 [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97: 5089-5096.

[7] Hao Jiang, Yin Chen, Peixia Jiang, et al. Methanotrophs: Multifunctional bacteria with promising applications in environmental bioengineering [J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 49: 277-288.

[8] KOTELNIKOVA S. Microbial product ion and oxidation of methane in deep subsurface [Review] [J] .Earth - Science Reviews, 2002, 58(3-4): 367-395.

[9] 宋继臣，刘靖阳.讨论对掘进工作面末端通风及瓦斯管理[J].煤炭技术, 2001, 20(7)：33-34.

[10] 陈东科,王璐,金龙哲,等.利用微生物技术治理煤矿瓦斯的研究展望[J].矿业安全与环保,2005，32(6)：49-52.

[11] 尉迟力，缪德埙，李树本，等.甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium 3011 甲醇累积条件的研究[J].工业微生物，1995，25(2)：10-13.