大孔吸附树脂富集款冬花总黄酮的研究

李 月，李 喆

(1.中国医科大学附属第一医院药学部，辽宁 沈阳 110001;2.吉林大学第二医院药品管理部，吉林 长春 130041)

款冬花为菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾。味辛、微苦，性温。具有润肺下气、止咳化痰的功效，主治新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血[1]。现代药理研究表明，款冬花有支气管解痉、中枢兴奋、镇痛抗炎、抗血小板聚集等作用，款冬二醇、芦丁、槲皮素等黄酮类化合物为其有效成分[2]。大孔吸附树脂用于中药制药技术已日趋成熟，在中药材有效部位的富集方面具有明显优势。作者在此进行了大孔吸附树脂富集款冬花总黄酮的研究。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

款冬花药材购于沈阳天益堂，经鉴定为菊科植物款冬花(TussilagofarfaraL.)的花蕾，粉碎过40目筛，80 ℃烘干，备用。

芦丁对照品(批号：100080-200306),中国食品药品检定研究院；D101、HPD300、HPD600型大孔吸附树脂，河北沧州宝恩化工有限公司；X-5、AB-8型大孔吸附树脂，天津南开大学化工厂；其它试剂均为分析纯；水为纯化水。

紫外可见分光光度计，恒温水浴振荡器，旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 样品液制备与总黄酮含量测定

取款冬花粉于锥形瓶中，用60%乙醇按液料比20∶1(mL∶g，下同)浸泡10 min，微波处理(微波功率300 W，处理时间9 min)，过滤，减压浓缩，用石油醚萃取至醚层无色(除去叶绿素)，即得款冬花样品液(其中总黄酮含量为2.76 mg·mL-1)，备用。

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系统发生显色反应，用分光光度计在500 nm波长处测定款冬花总黄酮含量[3]。以芦丁为对照品绘制标准曲线，回归方程为：A=9.7511c+0.0065(R=0.9993)，线性范围为13.2～66.0 μg·mL-1。

1.2.2 树脂的筛选

将15 mL预处理过的不同型号湿树脂置于具塞锥形瓶中，各加样品液30 mL，置于25 ℃恒温水浴振荡器中振荡24 h，过滤，测定滤液中总黄酮含量，计算静态吸附量。再将已吸附款冬花总黄酮的树脂置于具塞锥形瓶中，各加入60%乙醇30 mL，置于25 ℃恒温水浴振荡器中振荡2 h，过滤，测定解吸液中总黄酮含量，计算解吸率。

式中：m0为吸附前样品液的总黄酮含量；m1为吸附后滤液的总黄酮含量；V为树脂体积；m2为解吸液的总黄酮含量。

1.2.3 AB-8大孔吸附树脂富集款冬花总黄酮的工艺参数优化

将4 BV的款冬花样品液以3 BV·h-1的上样流速通过树脂柱(1 BV约为20 mL)，动态吸附40 min；用4 BV纯化水以1 BV·h-1的速度冲洗至几乎无色，再用4 BV 60%乙醇以4 BV·h-1的速度洗脱至几乎无色，收集洗脱液，回收乙醇，计算洗脱液中款冬花总黄酮的纯度及回收率。

通过单因素实验，依次考察上样量(上样速度为1 BV·h-1)、上样速度、吸附时间、纯化水用量、纯化水冲洗速度、乙醇体积分数、乙醇用量对总黄酮纯度和回收率的影响，确定优化的富集工艺。

2 结果与讨论

2.1 树脂筛选结果(表1)

表1 5种大孔吸附树脂的静态吸附、解吸参数

由表1可见，AB-8型大孔吸附树脂对款冬花总黄酮的静态吸附量和解吸率均最高。因此，选用AB-8型大孔吸附树脂富集款冬花总黄酮。

2.2 AB-8型大孔吸附树脂富集款冬花总黄酮的影响因素

2.2.1 上样量

实验发现，上样量为2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV时，总黄酮的纯度分别为70.5%、71.3%、72.1%、68.7%、65.8%，回收率分别为88.0%、89.2%、92.8%、74.3%、66.1%。可见，上样量为4 BV时，AB-8型大孔吸附树脂对款冬花总黄酮的富集效果最好，且避免了树脂过饱和造成的黄酮成分流失。因此，确定适宜的上样量为4 BV。

2.2.2 上样速度

实验发现，上样速度为1 BV·h-1、2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1时，总黄酮的纯度分别为72.0%、72.3%、72.5%、64.5%，回收率分别为92.3%、91.3%、92.0%、79.8%。可见，上样速度过快，款冬花总黄酮成分流失较多；上样速度过慢，操作时间又太长。因此，确定适宜的上样速度为3 BV·h-1。

2.2.3 吸附时间

实验发现，吸附时间为20 min、40 min、60 min时，总黄酮的回收率分别为77.6%、89.3%、84.4%。可见，吸附时间过短，黄酮成分未充分吸附；吸附时间过长，出现“死吸附”现象。因此，确定适宜的吸附时间为40 min。

2.2.4 纯化水用量

实验发现，纯化水用量为2 BV、4 BV、6 BV时，总黄酮的纯度分别为56.2%、72.2%、72.4%，回收率分别为87.7%、90.6%、79.3%。可见，水用量过少，杂质未完全除去，影响洗脱液中总黄酮的纯度；水用量过多，易造成黄酮成分损失。因此，综合考虑富集效果、总黄酮的回收率和节约用水等因素，确定适宜的纯化水用量为4 BV。

2.2.5 纯化水冲洗速度

实验利用黄酮类化合物与氯化铝反应生成黄色荧光络合物的性质[4]，对水洗液进行薄层检测。结果发现，纯化水冲洗速度为2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1时，薄层检测均无异常，但冲洗速度达8 BV·h-1时，水洗液的薄层检测呈淡黄色荧光，说明出现了黄酮成分的流失。因此，为了既保证总黄酮的回收率又节约操作时间，确定适宜的纯化水冲洗速度为6 BV·h-1。

2.2.6 洗脱剂乙醇体积分数

实验发现，洗脱剂乙醇的体积分数为40%、50%、60%、70%、80%时，总黄酮的回收率分别为51.1%、78.1%、91.4%、90.1%、89.3%，乙醇体积分数为60%～80%时无明显差异。因此，确定适宜的洗脱剂为60%乙醇。

2.2.7 洗脱剂乙醇用量

实验发现，洗脱剂乙醇用量为3 BV、4 BV、5 BV时，总黄酮的回收率分别为77.3%、92.6%、93.2%。综合考虑生产成本与生产周期，确定适宜的洗脱剂乙醇用量为4 BV。

2.3 AB-8型大孔吸附树脂的稳定性

将处理好的AB-8型大孔吸附树脂湿法装柱，取4 BV的款冬花样品液以3 BV·h-1的流速上柱吸附40 min，用4 BV的纯化水以6 BV·h-1的速度冲洗杂质，再用4 BV的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮的纯度和回收率，重复进行以上操作。结果，进行到第7次实验时，总黄酮的纯度和回收率均大幅下降，分别为48.7%和70.3%。表明，AB-8型大孔吸附树脂可以连续使用6次，之后需要进行再生处理。

2.4 讨论

1)预实验中发现，洗脱剂的洗脱速度不同时的富集效果无统计学差异。

2)有文献报道，树脂柱的径高比也是影响富集效果的因素之一。但受实验室仪器安装等具体条件的限制，本实验未能对树脂柱径高比进行考察。

3 结论

通过静态吸附、解吸的筛选实验，确定富集款冬花总黄酮的树脂为AB-8型大孔吸附树脂。通过单因素实验，以富集后总黄酮的纯度和回收率为指标，确定款冬花总黄酮适宜的富集工艺为：将4 BV款冬花样品液以3 BV·h-1的速度上样，吸附40 min，用4 BV的纯化水以6 BV·h-1的速度冲洗杂质，再用4 BV的60%乙醇洗脱总黄酮。该树脂稳定性良好，可连续使用6次。此富集工艺简单、可行，富集所得款冬花总黄酮的纯度和回收率均较高，为工业化生产奠定了基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：312.

[2] 吕培霖，李成义，翟丽芳.款冬花化学成分和药理作用研究进展[J].中国药房，2007，18(12)：948-949.

[3] 宋宏新，杨芳.大孔吸附树脂分离贯叶连翘中黄酮类化合物[J].医药导报，2012，31(5)：645-647.

[4] 腾坤，阮洪生，武子敬，等.大孔吸附树脂纯化藤梨根中总黄酮工艺优选[J].医药导报，2013,32(1)：63-65.