灵芝化学成分分析方法的研究

王明蛟，高 航，刚婉娇，邱智东，徐 伟*

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117;2.吉林财经大学医院，长春 130117）

灵芝化学成分分析方法的研究

王明蛟1，高 航2，刚婉娇1，邱智东1，徐 伟1*

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117;2.吉林财经大学医院，长春 130117）

灵芝是我国医学宝库中珍贵的药用真菌。现代药理学研究表明，灵芝含有多种生物活性物质，主要化学成分为多糖类、三萜类、甾醇类、核苷类、氨基酸及微量元素等，具有抗肿瘤、抗衰老、抗凝血、抗感染镇痛、保护心脏、调节免疫及降血糖等作用。在临床上对慢性支气管炎、哮喘、冠心病、心绞痛及高脂血症、高血压病、神经衰弱、肝炎、白细胞减少症、肿瘤、风湿等具有很好的疗效。在肿瘤的治疗中，与化学治疗或放射治疗合用时，灵芝多糖对胃癌、肺癌、肝癌等辅助治疗作用显著。

灵芝;化学成分;提取纯化;药理作用

灵芝来源于多孔菌科灵芝属真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝 G.sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体。灵芝作为我国传统补益药，具有补气安神、止咳平喘的功效［1］，其所含的化学成分较复杂，因所用菌种的培养方法、提取分离等不同而异，主要含有多糖类、三萜类、甾醇类、核苷类、氨基酸及微量元素等。本文重点就灵芝中常见化学成分的检测与分析方法作一概述。

1 灵芝中多糖类成分的测定

灵芝多糖由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物，是灵芝主要有效成分之一。目前，已分离出200多种灵芝多糖，大部分为β型葡聚糖，少数为α型葡聚糖。灵芝多糖具有广泛的药理活性，能提高机体免疫力、清除自由基，抑制肿瘤等。常见的提取方法有热水浸提法［2］、水提醇沉法、超声波提取法、微波提取法、超临界萃取法等;分析检测方法主要有硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法、水杨酸法、CE、HPLC、GC、IR、MS、NMR 等;多糖的分子量可通过凝胶柱色谱如SephadeaxG-100柱色谱、超离心测沉降系数等方法测定。

游丽君等［3］比较了超声波法、超声波结合纤维素酶法、超声波结合胰酶法、传统热水提取法4种方法提取灵芝多糖的性质区别。结果表明采用超声波结合胰酶法提取多糖得率最高，可达4.93%，比传统水提法得率高1.58倍。相比传统水提法所得多糖的分子量，超声处理可显著降低。此外，采用超声波结合胰酶法提取的多糖也具有较好的抗氧化活性，因此超声波结合胰酶法切实、有效，有望成为灵芝品种选育的一项重要手段。杨祖金等［4］采用卷式超滤膜对灵芝多糖进行分离提取研究。结果显示膜截留分子量6 000 D、超滤温度45～50℃、超滤压力0.6 mPa、时间45 min，制得灵芝多糖的纯度73.5%，回收率69.4%。表明超滤膜技术分离提纯灵芝多糖工艺简单、效果较好、有产业化前景。

2 灵芝中三萜类成分的测定

灵芝三萜是灵芝的主要成分之一，目前各种灵芝中分离到的三萜类化合物已达100多种，其中大部分为C30的灵芝酸、C27的赤芝酸，此外还有赤芝酮、灵芝内酯等。研究发现灵芝三萜具有护肝、抗高血压、抗肿瘤等药理活性。其主要提取方法有超声波辅助提取、有机溶剂浸提、超临界CO2萃取、大孔树脂分离提取等技术;纯化技术主要有吸附色谱法、高效液相色谱法等;常规检测手段有TLC、UV、HPLC、CE等。

朱忠敏等［5］采用高速逆流色谱法分离纯化灵芝提取物中的灵芝酸。结果显示在溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=5∶5∶3∶7的条件下，主机转速900 r/min，流速3 mL/min，检测波长254 nm，上样量20 mL，经1次高速逆流色谱分离，可从灵芝提取物中分离得到两种含量较高的灵芝酸。该方法具有样品容量大、分离效率高等特点，在灵芝酸等结构相似的化合物分离纯化方面具有广泛应用前景。

3 灵芝中甾醇类成分的测定

灵芝中甾醇类成分是从其脂溶性分离物中提取的活性物质，含量较高。目前从灵芝中分离的甾醇有近20种，其骨架分为麦角甾醇和胆甾醇2种类型。甾醇类成分对人体具有较强的抗感染作用，对预防治疗冠状动脉硬化类心脏病、溃疡、宫颈癌等有明显疗效，因此，对人参中甾醇类成分进行测定非常必要。

何荣军等［6］采用高速剪切闪式提取技术从灵芝中提取总甾醇。GC-MS分析表明灵芝总甾醇提取物中主要含有麦角甾醇和麦角甾-7，22-二烯-3β-醇。通过单因素实验和响应面实验优化提取工艺，麦角甾醇实际得率为0.072 1%。与传统提取法相比，闪式提取法通过负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用使溶质迅速进入溶剂，能显著降低提取时间和温度，更适合甾醇的提取。

4 灵芝中核苷类成分的测定

灵芝中核苷类成分是具有广泛生理活性的一类水溶性成分，主要有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌等作用。目前已从灵芝中分得核苷类物质有尿嘧啶、腺嘌呤、腺苷等，核苷类物质在灵芝中含量甚微，化学结构极其相似，很难被分离。

杨丰庆等［7］采用毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分。CE条件为熔融石英毛细管柱（120 cm ×50 μm），缓冲液体系 100 mmol/L甲酸-10%甲醇水溶液。运行电压25 kV;毛细管温度25℃。MS条件为0.3%甲酸-75%甲醇水溶液为鞘液，流速3 μL/min;干燥气体流速6 L/min，干燥温度350℃:采用ESI正离子模式检测，全扫描范围m/z 50～350。以5-氯胞嘧啶阿拉伯糖苷为内标物。结果表明具有较好的线性关系，除鸟苷外其他成分均R2＞0.990;加样回收率在95.3% ～104.6%。因此，CEMS适合用于中药中核苷类成分的分析检测。

5 灵芝中氨基酸成分的测定

灵芝是氨基酸的“贮存库”，含有赖氨酸、亮氨酸等，占灵芝的10%以上。在总的氨基酸中人体必需的氨基酸占总氨基酸30%～40%。灵芝氨基酸具有种类多、含量高、活性高、易被人体吸收的特点，与灵芝多糖协同作用具有强烈的抗肿瘤活性。目前对于灵芝中氨基酸类成分的分析报道［8］较多，大多依赖于氨基酸分析仪对总氨基酸的测定。

商振华等［9］采用反相高效液相色谱-紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量。以醋酸钠缓冲液和乙腈

水线性梯度洗脱。在室温下对常见的16种FDNB衍生化氨基酸进行了有效的分离，用紫外吸收检测器（360 nm）和外标定量法对灵芝蛋白中各种氨基酸的含量进行了测定。结果表明FDNB衍生化氨基酸在1周内是稳定的，回收率在96% ～102%，相对标准偏差小于4%，故灵芝中含有人体必需的赖氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等组分。

6 灵芝中微量元素的测定

灵芝中含有多种微量元素，如 Mn、Mg、Ca、Cu、Ce、Sr等，灵芝中微量元素的分析方法主要有灰化法、热分析法、非完全消化法、微波消解法、质子激发X射线分析法、中子活化法、X射线荧光分析法等;检测方法主要有原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法等。

刘立行等［10］建立非完全消化-FAAS法测定灵芝及人参中微量元素的新方法。在低温下用高氯酸-硝酸（1+3）混合酸消解样品，再加入乳化剂TritonX-100溶解油脂配制成均匀透明的样品溶液。对样品处理条件、化学干扰、背景吸收干扰、检出限及特征浓度进行考察，测定结果的相对标准偏差≤3.9%，本方法测定结果与灰化法一致，相对误差＜±2.3%。由此表明在火焰原子吸收法中，用非完全消化法取代灰化法对灵芝、人参样品进行预处理是可行的，且方法简便、准确。吴方方等［11］采用电感耦合等离子体质谱仪测定松杉灵芝中29种微量元素的含量。结果松杉灵芝菌盖中Al、Fe、Zn、Mn含量比赤芝菌盖高。同时表明该法简单、快速、切实可行。

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［1］中华人民共和国药典委员会.中国药典（一部）［M］.北京:化学工业出版社，2010:174.

［2］马明辉，吕丽娟，贡济宇，等.灵芝提取工艺的研究［J］.长春中医药大学学报，2007，23（3）:24-25.

［3］游丽君，冯梦莹，刘钧发，等.不同提取方法对灵芝多糖性质的影响研究［J］.现代食品科技，2013，29（6）:1207-1212.

［4］杨祖金，江燕斌，葛发欢，等.超滤膜技术分离灵芝多糖的研究［J］.中药材，2009，32（1）:126-129.

［5］朱忠敏，李晔，姚渭溪，等.高速逆流色谱分离纯化灵芝酸［C］//2011国际灵芝研究学术会议论文集.北京:2011国际灵芝研究学术会议，2011:24-25.

［6］何荣军，周菲，赵月钧，等.灵芝总甾醇的闪式提取工艺优化及其抗氧化活性［J］.食品与发酵工业，2013，39（9）:200.

［7］杨丰庆，张雪梅，葛莉亚，等.毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分［J］.中国药科大学学报，2011，42（4）:337-341.

［8］陈体强，徐洁，吴锦忠.福建省常见灵芝的氨基酸分析比较［J］.海峡药学，2004，16（5）:1-4.

［9］商振华，于亿年，郭为，等.反相高效液相色谱－紫外吸收法测定灵芝中氨基酸的含量［J］.药物分析杂志，1994，14（4）:30-33.

［10］刘立行，马蔷.非完全消化-FAAS法测定灵芝及人参中微量元素［J］.山东中医药大学学报，2006，30（5）:390-391.

［11］吴方方，汪均金植，王绍柏，等.松杉灵芝29种微量元素分析［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（4）:35-38.

Research on the analysis methods for chemical constituents in Ganoderma lucidum

WANG Mingjiao1，GAO Hang2，GANG Wanjiao1，QIU Zhidong1，XU Wei1*
（1.College of Pharmacy，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Hospital of Jilin University of Finance and Economics，Changchun 130117，China）

Ganoderma lucidum is the precious medicinal fungi of traditional Chinese medicine.Modern pharmacology study shows that Ganoderma lucidum contains a variety of biological active substance，the main chemical compositions are polysaccharide，triterpene，sterol，nucleotides，amino acids and microelements，etc.，which has the anti-tumor，anti-aging，anticoagulant，anti-inflammatory analgesic，heart-protecting，immune regulation，blood sugar regulation，etc.In clinic，Ganoderma lucidum has a very good effect for the treatment of chronic bronchitis，asthma，hyperlipidemia，hypertension，coronary heart dis-ease，angina，neurasthenia，hepatitis，white blood cells reduce disease，tumor，rheumatism and so on.Ganoderma lucidum polysaccharides has a positive effect on the adjuvant treatment of chemotherapy or radiotherapy on gastric cancer，lung cancer，liver cancer，etc.

Ganoderma lucidum;chemical component;extraction and purification;pharmacologic action

R284.1

A

2095－6258（2014）05－0817－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.021

国家科技支撑计划课题（2012BAI29B00）。

王明蛟（1988－），女，硕士研究生。研究方向:中药制剂研究。

徐伟，副教授，电话:0431-86172786，电子信箱:xuwei19802006@126.com。

2014－03－17）