不同产地野生与栽培伊贝母药材水溶性成分指纹图谱研究

盛 萍，安露莎，苗莉娟，姚 蓝，2，史 红，2，张 煊

(1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011 )

伊贝母是《中华人民共和国药典》收载的、常用名贵大宗药材，为百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鳞茎。自1977年始收载在《中华人民共和国药典》历次版本中。性微寒，味苦，归肺、心经。具有清热润肺，化痰止咳之功效。临床上常用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳咳，咳痰带血等症[1]。在临床应有方面与药材川贝母相同，是中医处方和中成药生产常用的名贵药材。其野生品种仅分布在中国新疆境内[2-3]，为国家三级重点保护野生药材。由于野生伊贝母药材资源破坏严重，目前伊贝母资源在低山带已经绝迹，中山带仅在灌木丛中零星分布。伊贝母人工栽培自20世纪70年代开始引种成功，而大量投入生产、商品供应市场，是从90年代中末期开始，目前大规模种植伊贝母产业已成为拉动新疆当地农牧民收入的重要途径。近年伊贝母作为我区道地药材的种植面积逐渐扩大, 而这一举措也有效缓解了伊贝母药材市场供应的紧张局面。

伊贝母的主要活性成分为生物碱、皂苷类成分[4]，目前对伊贝母的研究主要集中在生物碱成分方面[5-10]，对生物碱指纹图谱的研究也有报道[11]，而对其水溶性成分研究甚少[12]。近年研究表明，贝母中水溶性成分主要为核苷和腺苷(adenosine) ，具有抗炎、抑制血小板凝聚、降压、松弛平滑肌等作用[13-14]，而贝母的抗炎作用能协同治疗呼吸道感染，是贝母止咳化痰的药理学基础[15]。但在2010版《中国药典》(一部)仅给出了伊贝母西贝母碱、西贝母碱苷含量测定质量控制指标，这对于药材内在质量的评价存在一定的局限性。

因此，本文采用HPLC技术结合相似度分析方法，对不同产地野生与栽培29批伊贝母药材的水溶性指纹图谱进行了系统的研究，以期为进一步控制其质量，促进伊贝母药材的栽培和开发利用提供一定参考依据。

1 仪器与材料

日本岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，包括LC-20AT四元泵，SPD-M20A二极管阵列检测器；TGL-16G台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。色谱级甲醇(Fisher Scientific)，水为屈臣氏水，其他试剂均为分析纯。

本实验所用野生与栽培伊贝母药材均采自药材主产地新疆霍城县、温泉县、巩留县、新源县、乌苏县、呼图壁县、米泉、吉木萨尔县、奇台县、木垒县等不同产地，伊贝母药材样品信息见表1。经鉴定为百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鳞茎。凭证标本存放于新疆医科大学中医学院中药资源教研室。药材经60 ℃烘干后粉碎，过80目筛，备用。对照品腺苷(批号110879-200202，Adenosine)，购于中国药品生物制品检定所；β-胸苷(批号89270-1G，Thymidine，SIGMA-ALDRICH)，纯度均大于99.0%。

表1 不同产地伊贝母药材品种及HPLC指纹图谱共有峰的相似度

续表1

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相：A(甲醇)-B(水)梯度洗脱：0～20 min(B 93%)；20～25 min(B 93%～80%)；25～55 min(B 80%～70%)；55～80 min(B 70%～50%)；80～90 min(B 50%～30%)；90～100 min(B 30%～20%)。流速0.5 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长260 nm；进样量15 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品β-胸苷、腺苷各5.75 mg，加水制成每mL含腺苷0.115 0 mg，β-胸苷0.011 50 mg的溶液，加水超声溶解，即得标准品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末1.5 g，置50 mL锥形瓶中，精密加水10 mL，混匀，称重，室温下超声提取60 min(50 kHz)，取出，放冷，补足失重，摇匀，倒入离心管中，离心5 min(10 000 r·min-1)，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取供试品溶液(S1)，按2.1项下方法连续进样6次进行检测，以5号峰β-胸苷为参照峰计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.56%，表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同批样品(S1) 6份，按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液，进行测定。以5号峰β-胸苷为参照峰计算各共有峰相对保留时间和相对保留分房面积的RSD均小于2.45%，表明重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(S1)，分别在0，2，4，8，12，24，36，48 h进行测定，以5号峰β-胸苷为参照峰计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.90%，说明样品溶液在48 h内稳定。

2.4 β-胸苷和腺苷线性关系考察

分别精密吸取标准品溶液β-胸苷5、10、20、30、40、50 μL，标准品溶液腺苷2、4、6、8、10、12、14、16 μL注入HPLC仪，按2.1项下条件及方法测定色谱峰面积，以色谱峰面积为应变量y，浓度为自变量x(μg/μL)，进行线性回归，得β-胸苷的回归方程为Y=5.786 2×106X+8 578.8，r=0.999 9，表明β-胸苷在0.057 5～0.575 μg·μl-1范围内线性关系良好；得腺苷的回归方程为Y=6.506 95×106X+44 612.7，r=0.999 9，表明腺苷在0.23～1.84 μg·μl-1范围内线性关系良好。

2.5 HPLC指纹图谱中的特征峰

在2.1项色谱条件下，对29批不同产地野生与栽培伊贝母药材样品进行检测，比较各样品色谱图的检测结果, 标定了14个主要共有峰，其中指认了5号峰为β-胸苷，7号峰为腺苷。共有峰面积占所有峰面积的百分比为79.8%～95.6%。29批伊贝母药材样品HPLC指纹图谱见图1。

图1 不同产地伊贝母药材HPLC指纹图谱图

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 指纹图谱的建立及相似度评价 从新疆各产地采集的野生与栽培伊贝母药材样品，记录其指纹图谱(图1)，并将所得的29批伊贝母药材样品色谱图依次导入国家药典会编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版》软件，对从不同产地野生与栽培的伊贝母药材的指纹图谱进行数据处理, 生成对照指纹图谱(图2), 不同产地野生与栽培伊贝母药材的相似度见表1。除了批号S1，S4，S5，S7，S8，S9，S17的相似度在0.8以下较低外，其余不同产地野生与栽培伊贝母药材指纹图谱的相似度均较高，见表2。

表2 29批伊贝母药材样品β-胸苷和腺苷测定结果(n=3)

2.6.2 指纹图谱系统聚类分析 将29批不同产地野生与栽培伊贝母药材的HPLC指纹图谱14个共有色谱峰的峰面积与药材称样量相比，即对单位质量药材峰面积进行量化，得到29×14阶的数据矩阵，应用SPSS 18.0分析软件，采用Ward方法和卡方度量进行聚类分析，分析结果见图3。图3为全部29个药材样本的聚类图。依据聚类图，在相似距离为10处，有5个分支组。分支组Ⅰ包括不同产地的(米泉县、吉木萨尔县、玛纳斯县、沙湾县、乌苏县巴音沟)新疆贝母野生药材样本(1，2，5，6，9) 和不同产地的(奇台县、乌苏县白杨沟、新源县、霍城县)新疆贝母野生与栽培的药材样本(3, 7，14，15)，其中15从霍城县购买的样本很可能是新源县栽培的新疆贝母，故能很好地聚在一起；分支组Ⅱ包括两个产地伊犁州巩留县、新源县伊犁贝母栽培样本(10，11，23, 25，26，27，28)，其中10、11从药业公司和药店购买的样本很可能就是这两个产地栽培的伊犁贝母；分支组Ⅲ包括了不同产地的(温泉县、霍城县果子沟、霍城县芦草沟)伊犁贝母野生与栽培的药材样本(18，19，17，21)，其中栽培的21号样本生长环境(霍城县芦草沟)与其野生生长环境(温泉县、霍城县)大体相同，故能很好地聚在一起；分支组Ⅳ包括不同产地的(呼图壁县、乌苏县白杨沟、新源县、伊犁赛里木湖)新疆贝母野生与栽培的药材样本(4，8，12, 13，16)和伊犁贝母野生的药材样本 (20)；分支组Ⅴ由不同产地的(巩留县、温泉县)伊犁贝母栽培的药材样本 (22, 24，29) 组成，其中温泉县伊犁贝母栽培的种苗一般均从大规模种植产地巩留县购买，故其内在质量相似性、稳定性较好。在相似距离为15处，有4个分支组，除了分支组Ⅰ包括了在相似距离为10处时的分支组Ⅰ和Ⅱ外，其余分支组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别对应在相似距离为10处时的分支组Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。从整个聚类图可看出，29个药材样本先根据品种的野生与栽培分别聚类，再根据品种(新疆贝母、伊犁贝母)聚在一起，虽然不同产地、野生与栽培药材成分的个体差异有所不同，但不同产地、野生与栽培的药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌很相似。

5.β-胸苷 7.腺苷

2.7 β-胸苷和腺苷测定

按2.2.2项下方法制备供试品溶液，对29 批伊贝母样品中β-胸苷和腺苷进行测定，检测波长260 nm，每批样品溶液平行测定3 次。以平均相对峰面积按标准曲线方程法计算各批次样品中β-胸苷和腺苷质量分数，结果见表2。

图3 不同产地伊贝母药材HPLC指纹图谱聚类图

3 讨 论

3.1 分别比较了流动相乙腈-水、甲醇-水的分离效果，发现甲醇-水效果较好，色谱图基线平稳，出峰数目及分离度都比较理想，最终确定了甲醇-水流动相及其洗脱梯度。分别比较了Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Hypersil C18色谱柱(4. 6 mm×250mm，5 μm)，以Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分离度好，色谱峰对称性好，基线平稳。采用DAD检测器对样品在200～400 nm波段范围内进行扫描，综合考虑不同波长下色谱峰的数目、峰面积大小、色谱峰分离度及紫外，因此最终选择260 nm为最佳测定波长。

3.2 中药多以水煎剂为主, 其水溶性成分的药理药效研究已受到一定的关注。贝母中水溶性成分主要为核苷和腺苷。为了尽可能的体现伊贝母药材所含水溶性化学成分的特征，以提取效率、β-胸苷和腺苷的总量为考察指标, 以提取温度、甲醇和水的体积比、提取时间和溶剂用量为考察因素,采用单因素和L9(34)正交试验优选了伊贝母水溶性成分的最佳提取工艺，最终确定提取方法为10 mL水超声提取60 min。

3.3 本文首次建立了伊贝母药材水溶性成分HPLC指纹图谱测定方法。该方法能使伊贝母药材水提取物中大部分化学成分得到较好的分离，且精密度、重复性、稳定性较好，为伊贝母药材的质量综合评价提供一定参考依据。

3.4 对29批采自新疆主要产地野生与栽培的伊贝母药材样品进行了水溶性成分HPLC指纹图谱分析，确定了14个共有色谱峰。根据各色谱峰的波谱特征，结合贝母类药材水溶性成分文献[16]报道可知，该指纹图谱中主要成分为核苷类成分。根据样品峰保留时间鉴定了第5、7号色谱峰分别对应为β-胸苷和腺苷。

3.5 首次对29 批不同产地野生与栽培伊贝母药材水溶性成分HPLC指纹图谱进行了相似度计算和聚类分析。根据29个产地野生与栽培伊贝母药材的分析结果可看出，不同产地、野生与栽培的其药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，除了批号S1，S4，S5，S7，S8，S9，S17的相似度在0.8以下较低外，其余不同产地野生与栽培伊贝母药材指纹图谱的相似度均较高。说明不同产地栽培伊贝母药材质量有较好的相似性。其中，相似度较低的样本均为野生品种，说明野生品种所处的生长环境对药材的内在质量有较大的影响。聚类分析表明，29个药材样本先根据品种的野生与栽培分别聚类，再根据品种(新疆贝母、伊犁贝母)聚在一起。如在相似距离为10处，分支组Ⅰ先与不同产地的新疆贝母野生药材样本聚类，再与不同产地的新疆贝母野生与栽培的药材样本；在相似距离为15处，分支组Ⅰ包括了不同产地新疆贝母野生与栽培药材样本。又如在相似距离为10处，分支组Ⅱ包括新疆伊犁州两个大规模种植伊犁贝母的产地：巩留县和、新源县药材样本；分支组Ⅲ包括了不同产地的伊犁贝母野生与栽培的药材样本。同时聚类分析结果进一步表明，伊贝母栽培药材的质量较稳定可控。虽然不同产地、野生与栽培药材成分的个体差异有所不同，但不同产地29批野生与栽培的药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌很相似，可作为伊贝母药材的特征指纹图谱。

3.6 虽然不同批次，不同产地野生与栽培药材指纹图谱中主要化学成分的整体图貌基本一致，但β-胸苷和腺苷含量差异较大(0.03～0.29之间；1.84～7.28之间)，这可能与不同产地土壤因子、气候因子、干燥、加工等因素有关。因此有必要在指纹图谱评价基础上尽可能增加有效成分的定量测定，进一步评价药材质量。

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