有柄石韦中多糖提取工艺的优化

程丹丹，高德民

(山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355)

有柄石韦[Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching]为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia)植物。具有利尿、通淋、清湿热之功效。临床上用于热淋、血淋、石淋、小便不通，主治肺炎水肿、膀胱炎、泌尿系结石、尿血、崩漏、肺热喘咳[1]。石韦的主要活性成分为槲皮素、山奈酚、异槲皮苷、芒果苷等[2]黄酮类物质，以及多糖类，萜类等[3]。多糖类是现今研究的热点，已发现的100多种具有免疫调节、抗肿瘤[4]、抗病毒、抗感染、降血糖[5]等多种生理活性的中药多糖，部分已在临床用于肿瘤、肝炎、心血管等疾病的辅助治疗和康复[6]，其中最重要的药理作用当推免疫促进作用，因此多糖的提取备受关注。但对石韦中多糖的研究，尤其是对石韦多糖的提取，分离、纯化及含量测定等方面的研究较少。为此，本研究对有柄石韦中总多糖的提取工艺进行优化，筛选出最佳的提取条件，提高多糖得率，为有柄石韦的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料、仪器和试剂

1.1 材料

有柄石韦经过粉碎用石油醚浸泡过夜，料液比1∶20，加80%乙醇，回流加热提取4 h,过滤后晾干，储存备用[7]。

1.2 仪器与试剂

754PC紫外-可见光分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司；RE52AA旋转蒸发器,菏泽鑫源仪器仪表有限公司；FXB101-1加热鼓风干燥箱、KO-250E医用超声波清洗器,上海树立仪器代表有限公司；HH-S水浴锅,济南启科仪器有限公司；HZT-A100电子天平,福建华志科学仪器有限公司。浓硫酸(98.08%)，95%乙醇，苯酚，葡萄糖，氢氧化钠，氯仿，正丁醇等，实验所用试剂均为分析纯，购自天津富宇试剂公司。

2 方 法

2.1 石韦多糖的提取

石韦经过粉碎，并用石油醚浸泡过夜，料液比1∶20，加80%乙醇，回流加热提取4 h,过滤后晾干，称取50 g石韦粉末，溶入5 g/mL NaOH中，充分搅拌。按不同料液比，超声时间，超声温度，水浴温度，进行浸提 (表1)[7-8]。溶液经过旋转蒸发器旋转蒸发至体积约50 mL,边搅拌边加入3倍体积的95%乙醇，于4 ℃下静置12 h醇沉。醇沉后的样品溶液抽滤得到有效成分，溶于100 mL蒸馏水中调节pH为8～9。并取1/4体积的按照4∶1的比例取的氯仿和正丁醇，充分混合后在5 000 r/min条件下离心10 min，保留上层多糖溶液，进行2次醇沉。

表1 因素水平表

2.2 样品总多糖的测定

采用苯酚硫酸法制备标准曲线[9-10]，测定样品中总多糖含量。用紫外可见光分光光度计在490 nm处测量吸光度。以浓度对吸光度值做标准曲线，所得葡萄糖标准曲线及回归曲线方程为y=28.458x-0.074 3,r=0.999 6精密称取0.026 4 g的多糖粗品，分别用蒸馏水溶解定容至100 mL，摇匀。照以上方法测定吸光度。

3 结 果

3.1 结果分析

结果显示同一批石韦不同的提取方法，多糖的得率有很大差异(表2)，其中实验号1条件下提取率最高，且明显高于其它条件下的提取率。实验号3,5,6的得率最低，试验号2,4,7,8,9的提取率相差不大。综合分析结果可知，超声时间、超声温度、料液比、水浴温度在多糖提取中影响因素的大小顺序为：提取时间>超声时间>温度>料液比。有柄石韦中多糖提取最佳工艺参数组合为：超声温度40 ℃，提取时间60 min，料水比1∶8 g/mL，水浴时间130 min。即A1B1C1D1。

表2 正交试验设计及结果分析

3.2 试验验证

根据正交试验结果对A1B1C1D1条件进行3次实验，以验证该工艺的合理性和稳定性，结果无显著差异。最后确定的最佳提取工艺为料液比1∶8、超声时间60 min、超声温度40 ℃、水浴温度130 ℃。

4 讨 论

多糖类化合物是有柄石韦中有效成分之一[1]，研究表明其具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血糖等多种生理活性[11]。本研究以中药有柄石韦为研究对象，采用水提醇沉法提取其中的多糖，并运用紫外分光光度法在波长490 nm处测定了多糖的含量。通过正交试验法对提取工艺条件进行优化，并进行了验证试验，结果显示最佳提取工艺为料液比1∶8、超声时间60 min、超声温度40 ℃、水浴温度130 ℃。

随着超声时间的延长，多糖得率逐渐增大，但60 min后，多糖得率增加不明显。分析认为，当扩散达到平衡时，时间延长会使杂质的浸出增加，扩散出的多糖还会不断分解，所以60 min是比较适宜的提取时间。可以明显看出随着超声温度的增长，多糖的得率也明显上升。溶剂的温度增加分子的溶解速度也明显加快，这有利于多糖克服阻力。但是当温度过高时，多糖结构也有可能遭到破坏而受到抑制。

随着水浴温度的增长，多糖的得率也明显上升。但是当温度过高时，多糖结构也有可能遭到破坏而受到抑制。因此，控制合适的提取条件对多糖的提取效率及石韦的充分利用是至关重要的。石韦作为一种常用中药材，近年来被广泛用于各种复方制剂中[10]。多糖在有柄石韦中有着较高的含量。通过对有柄石韦中多糖提取工艺的优化，提高了石韦的利用率，为进一步分离纯化多糖类成分提供有利的条件。

参考文献：

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