花椒籽种皮黑色素理化性质和抗氧化活性的研究

杨秀芳，王改利，马养民

（陕西科技大学 1.教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室；2.化学与化工学院，陕西 西安 710021）

0 前言

植物黑色素（melanin）是一种无定性的大分子物质，一般难溶于水，不溶于有机溶剂，且结构复杂，性能各异[1].黑色素不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂[2]和免疫促进剂[3]，而且还是一类生物半导体材料[4].近期研究发现，黑色素具有抗蛇毒[5]、抗癌[6]、治疗帕金森症[7]等作用，这为现代医药和保健行业的发展提供了理论依据.作者以花椒籽种皮为原料，使用大孔吸附树脂纯化黑色素，对其理化性质和抗氧化活性进行了探讨，旨在为该黑色素的开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

花椒籽：陕西韩城金太阳花椒有限责任公司；福林酚试剂：上海三杰生物技术有限公司；DM130大孔吸附树脂：河北沧州吸附材料科技有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；恒温水浴锅：上海华晨医用仪表有限公司；水循环真空泵：郑州杜普仪器厂；摇床：上海浦东物理光学仪器厂.

1.3 试验方法

1.3.1 花椒籽种皮黑色素粗品及树脂纯化粗品的制备

称取花椒籽500 g，加入石油醚1 500 mL，浸泡24 h，过滤，称取脱脂后的花椒籽100 g，加入浓度为1.3 mol/L 的NaOH 1 000 mL，在90 ℃下回流提取1 h，提取液离心过滤后反复用11 mol/L HCl酸化，得到黑色素粗品.将得到的粗品使用大孔吸附树脂DM130 纯化后，干燥，备用.

1.3.2 花椒籽种皮黑色素结构归属

采用薄层色谱试验用1%的FeCl3-乙醇溶液与铁氰化钾水溶液等量混合作显色剂，点板，若显蓝-紫色斑点则表明为酚类物质；三氯化铁试验：取花椒籽黑色素的酸性乙醇提取液1 mL，加1 %FeCl3-乙醇溶液1～2 滴，若显绿色则表明为酚类物质.且以没食子酸为标准参考GB/T 8313—2008[8]中Folin-Ciocalteu 比色法（略有改动）.

1.3.3 光热稳定性

取经大孔吸附树脂纯化后的黑色素溶液，分别在室内自然光照射0、1、3、5、7、14、21、28 d，并在0、20、40、60、80、100 ℃下加热1 h，冷却后采用Folin-Ciocalteu 比色法，分别测定其吸光度.

1.3.4 pH 稳定性

取10 mL 纯化后黑色素溶液，分别用NaOH和HCl 调 节pH 值 为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，采用Folin-Ciocalteu 比色法，测定各溶液的吸光度.

1.3.5 氧化剂与还原剂稳定性

分别称取KMnO4、K2Cr2O7和Na2SO30.01 g，溶于100 mL 水中，分别加入纯化后的黑色素溶液10 mL，混合，然后分别在0、5、10、15、24、48 h，采用Folin-Ciocalteu 比色法测定其吸光度.

1.3.6 金属离子稳定性

分别配制浓度为0.015 mol/L 的Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、Fe3+、Cu2+离子溶液，各取1 mL 分别加入10 mL 纯化后相同浓度的黑色素溶液，采用Folin-Ciocalteu 比色法，分别在0、24、48 h测定其吸光度.

1.3.7 蔗糖、淀粉和食盐稳定性

分别称取蔗糖、淀粉和食盐0.01 g，溶于100 mL 水中，分别加入经DM130 树脂纯化后的溶液10 mL，混合，然后分别在0、24、48 h，采用Folin-Ciocalteu 比色法测定其吸光度.

1.4 抗氧化活性试验方法

1.4.1 ·OH 清除

取0.5 mmol/L 邻二氮菲溶液1.5 mL，加入pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液2.0 mL，混匀后加入0.75 mmol/L FeSO41.0 mL，混匀.加入不同浓度浓缩液1.0 mL，于510 nm 处测定吸光度A2，然后加入0.1%双氧水1.0 mL，37 ℃保温1 h，用蒸馏水代替浓缩液，测吸光度记为A1，以蒸馏水代替双氧水和样品液测吸光度A0，以Vc 作对照.·OH 清除率为：，并计算IC50值.

取4.5 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液，分别加入不同浓度样品溶液1 mL 和0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后反应5 min，然后加入8 mol/L 的HCl 1 mL 终止反应，在299 nm 处测其吸光度A1，以蒸馏水代替样品液测吸光度A0，以Vc作对照，并计算IC50值.

2 结果与分析

2.1 花椒籽种皮黑色素结构归属

按照1.3.2 中薄层色谱试验显蓝-紫色斑点，三氯化铁试验显绿色，均表明花椒籽种皮黑色素为酚类物质.

2.2 光热稳定性

花椒籽种皮黑色素在自然光下的吸光度值如图1 所示，由图1 可知，在自然光下花椒籽种皮黑色素随时间的延长吸光度值减少，但肉眼未看到明显的颜色变化，表明其耐光性差，可能的原因是黑色素发生了氧化反应.不同温度下花椒籽种皮黑色素的吸光度值如图2 所示，由图2 可知，在0～80 ℃下黑色素吸光度变化不大，但随着温度继续升高吸光度值增加，表明在0～80 ℃下耐热性良好.

图1 花椒籽种皮黑色素在自然光下的吸光度值

图2 不同温度下花椒籽种皮黑色素的吸光度值

2.3 pH 稳定性

花椒籽种皮黑色素在不同pH 下的吸光度值如图3 所示.pH＜5 时黑色素产生沉淀；pH＞7 时随着pH 增大吸光度值增大且颜色加深.可能的原因是碱性条件下黑色素以粒子形式存在，碱性越大离子越稳定.

图3 花椒籽种皮黑色素在不同pH 下的吸光度值

2.4 氧化剂与还原剂稳定性

加入还原剂Na2SO3的花椒籽种皮黑色素的吸光度值如图4 所示，由图4 可知，随着还原剂的加入黑色素的吸光度值明显降低，表明其耐还原性差，原因可能是加入还原剂使黑色素的结构发生变化.加入氧化剂的花椒籽种皮黑色素的吸光度值如图5 所示.由图5 可知，加入氧化剂KMnO4和K2Cr2O7的黑色素溶液吸光度值基本不变，表明该色素对KMnO4和K2Cr2O7稳定性良好.

图4 加入还原剂的花椒籽种皮黑色素的吸光度值

图5 加入氧化剂的花椒籽种皮黑色素的吸光度值

2.5 金属离子稳定性

加入离子Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Cu2+和Fe3+的花椒籽种皮黑色素产生沉淀，取上清液进行试验，结果见图6.由图6 可知，其中Cu2+和Fe3+溶液吸光度值增大，Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、K+溶液吸光度值减少.原因可能是离子与黑色素的部分基团结合形成沉淀，其中有些使该黑色素吸光度值增大，有些使其减少.

图6 加入金属离子的花椒籽种皮黑色素吸光度值

2.6 蔗糖、淀粉和食盐稳定性

加入蔗糖、淀粉和食盐的花椒籽种皮黑色素的吸光度如图7 所示，由图7 可知，加入蔗糖、淀粉和食盐的花椒籽种皮黑色素的吸光度值基本变化不大，表明花椒籽种皮黑色素可以作为天然的食品添加剂.

图7 加入蔗糖、淀粉和食盐的花椒籽种皮黑色素的吸光度

2.7 ·OH 清除（图8）

由图8 可知，花椒籽种皮黑色素抑制·OH 能力与Vc 相当，在20～160 μg/mL 范围内呈线性相关，其线性回归方程为y=0.601x+0.033，R2=0.984 0，半数抑制浓度为IC50为66.63 μg/mL.

力比Vc 好，在10～60 μg/mL 内呈线性相关，其线性回归方程为y=1.527x-1.113，R2=0.992 4，半数抑制浓度为IC50为36.55 μg/mL.

图8 花椒籽种皮黑色素对·OH 的清除

图9 花椒籽种皮黑色素对的清除

3 结论

作者对花椒籽种皮黑色素的理化性质进行了研究，结果表明该黑色素属于酚类物质，耐光性差，在0～80 ℃下耐热性良好；当pH＜5 时黑色素产生沉淀，pH ＞7 时吸光度值增大且颜色加深；对KMnO4和K2Cr2O7稳定性良好；对Na2SO3稳定性较差；该色素加入金属离子Mg2+、Fe2+、Zn2+、K+、Cu2+和Fe3+的溶液产生沉淀，其中Cu2+和Fe3+溶液吸光度值增大，Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Cr3+、Sn4+、K+溶液吸光度值减少；加入蔗糖、淀粉和食盐的该色素吸光度值基本不变，表明该黑色素是一种理想的食品添加剂；花椒籽种皮黑色素具有较好的抗氧化活性，其中清除·OH 能力与Vc 相当，其IC50为66.63 μg/mL；清除能力比Vc 好，其IC50为36.55 μg/mL.该黑色素可作为天然抗氧化物质的新来源.

［1］鲁京兰，崔成都，南昌熙.大葱籽黑色素提取工艺研究［J］.安微农业科学，2010，38（13）：7162-7164.

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［8］GB/T 8313—2008，茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法［S］.