酸枣内生真菌的分离及抑菌活性测定

高振峰，张宝俊，刘慧芹，刘慧平 ，韩巨才

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801; 2.天津农学院 园艺系， 天津 300384)

植物内生真菌是最早被发现、最早被开发应用的一类植物内生菌。与其他内生菌相比，植物内生真菌具有数量多、分布广、所产生活性物质种类多等特点。植物内生真菌代谢的活性物质主要有生物碱类、肽类、萜类、甾体类、酚类、醌类等化合物[1～3]，其中还有许多亟待开发的新物质，特别是植物内生真菌在筛选新型抗菌药物中有着巨大潜力。Strobel等[4]从短叶红豆杉的韧皮部分离到产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，张玲琪[5]、郭波[6]等均从长春花茎皮中分离到了产抗癌物质长春新碱的内生真菌。在植物病害生防方面，植物内生真菌也具很好的开发前景。近年来，我国的付建红[7]、杨润亚[8]、宋萍[9]、田小曼[10]、杨明琰[11]等众多学者从经济林木、药用植物、杂草等植物中分离到了大量的内生真菌，并在菌种多样性、抗病菌株筛选、活性成分分析、与寄主植物关系等方面进行了深入的研究。酸枣(Ziziphusjujubevar.spinosa)作为一种野生药用植物，有着极为丰富的药用成分，但是有关酸枣内生真菌的研究还少见报道。因此，本试验对酸枣内生真菌进行了分离、纯化，并对其抑菌活性进了研究，旨在丰富具有抑菌活性的内生真菌资源，分离具有生物活性的抗菌物质，为微生物源农药开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

酸枣的根、茎、叶于2012年8月采集于山西农业大学校园内。

1.1.2 供试病原菌

梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)，均由山西农业大学农药学实验室保存。

1.2 酸枣内生真菌的分离与纯化

将采集的植物材料用自来水冲洗30 min后进行表面消毒，程序为：先用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，3%的次氯酸钠浸泡3 min，无菌水冲洗后将消毒的材料用无菌刀片截成1 cm左右的小段，置于PDA培养基中[12]，28℃恒温培养，4 d后采用尖端菌丝纯化法进行纯化，根据形态、颜色、菌落的不同分类保存。

1.3 酸枣内生拮抗真菌的筛选

拮抗真菌的筛选采用平板对峙法[13]，将所分离的内生真菌放置于PDA平板上，在其约3 cm处分别接直径为5 cm的病原真菌菌块，28℃恒温培养，5 d后测定内生真菌的抑菌活性。以只接病原真菌为对照，3次重复。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5 mm)×100%

1.4 拮抗菌发酵液抑菌活性测定

将筛选的各拮抗菌株接种于PDA的液体培养中，28℃、150 r·min-1振荡培养96 h。用无菌纱布过滤获得菌丝体，晾干备用。发酵液在4℃、10 000 r·min-1离心10 min取上清发酵液，经0.45 μm微孔滤膜过滤灭菌。采用生长速率法[12]测定各菌株的发酵液活性，将各处理1 mL发酵液与9 mL PDA培养基混合制备平板，分别接入直径5 mm的5种病菌菌块，28℃培养。5 d后测定菌落直径，计算抑菌率，对照以无菌水替代发酵液，3次重复。

2 结果与分析

2.1 酸枣内生真菌的分离

本试验从酸枣不同部位分离到的内生真菌经纯化培养后，共获得40株内生真菌菌株，其中根部为20株，茎部15株，叶部5株。从分离结果可以看出，酸枣内生真菌的分布情况为根部最多，茎部次之，叶部最少。

2.2 酸枣内生真菌抑菌活性初筛

经测定，所分离的酸枣内生真菌中有25株具有抑菌活性，其中对B.cinerea的抑制率在40%～72%；对A.alternata的抑制率在19.5%～59.8%。其中SZJ-2、SZJ-5和SZJ-8的抑菌效果显著，对A.alternata和B.cinerea均有较好的抑制作用，对A.alternata的抑制率分别为59.2%、59.8%、53.5%；对B.cinerea的抑制率分别为70%、72%、70%。

2.3 拮抗真菌发酵液抑菌活性测定

3株内生真菌原始发酵液的抑菌活性如表1所示。SZJ-2对A.solani、B.cinerea、A.alternata、F.oxysporiumf.sp.vasinfectum和R.solani5种病原真菌的抑菌活性分别为70.7%、55.1%、66.7%、30.6%和36.6%；SZJ-5菌株为65.5%、29.2%、63.0%、15.3%和25.6%；SZJ-8菌株为62.1%、53.9%、57.4%、6.3%和31.7%。3株内生真菌对5种病原真菌的抑菌活性存在显著差异，其中对A.Solani和A.Alternata有着较强的抑菌活性，抑制率均在50%以上，对A.Solani的抑菌活性最强，其次是A.Alternata；此外，3株内生真菌中除了SZJ-5对B.cinerea的抑菌活性为29.2%外，其他2株内生真菌对B.cinerea的抑菌活性均在50%以上。

3 结论与讨论

本试验采用组织分离方法对酸枣内生真菌进行分离，以最后一次无菌水冲洗液为对照检测分离结果的可靠性。通过对分离到的40株内生真菌进行初筛发现25株具有抑菌活性，占分离总数的62.5%，其中SZJ-2、SZJ-5和SZJ-8有着较强的抑菌作用，说明在酸枣体内存在着具有抑菌活性的内生真菌，进一步证实了药用植物中存在着丰富的内生拮抗真菌。随后对3株内生真菌发酵液的抑菌活性进行了测定，发酵液经过滤处理后对番茄早疫病菌、梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌有着较强的抑制作用，SZJ-2和SZJ-8的抑制率均在50%以上，SZJ-5除了对番茄灰霉病菌的抑制率低于50%外，对其它2种病菌的抑菌活性均超过50%。SZJ-5发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性与菌株自身的抑菌活性表现出明显反差的原因可能是菌株SZJ-5对番茄灰霉病菌的抑菌活性物质存在于菌丝体内而非胞外代谢物中，具体原因需下一步对菌丝中的活性物质进行提取验证。通过试验证实3株内生真菌在防治番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和梨黑斑病菌上具有进一步开发的价值。因此，今后应进一步对这3株内生真菌进行系统研究，如进行菌种的鉴定、代谢物中抑菌活性物质的分离纯化、植物体内定殖力测定等，为生物农药的开发及应用提供试验依据。

表1 3株内生真菌发酵液对5种病原真菌的抑菌率(%)

注：同行的字母表示新复极差检验在P=0.05水平差异不显著。

Note： The data in the same row following by the same letters are not significantly different by Duncan's test (P=0.05).

参 考 文 献

[1]江曙,段金廒,钱大玮,等.当归内生真菌抗植物病原菌的活性研究[J].植物保护,2012,38(1):76-79.

[2]Strobel G A.Rainforest endophytes and bioactive products [J].Critical Reviews in Biotechnology, 2002, 22(2):315-333.

[3]Harper J K，Arif A M，Ford E J.Pestacin：a 1,3-dihydro isobenzofuran fromPestalotiopsismicrosporapossessing antioxidant and antimycotic activities[J].Tetrahedron,2003,59(14):2471-2476.

[4]Strobel G，Stierle A，Stierle D.Taxomyces andreana：A proposed new taxon for a bulbilliferous by phomycete associated with pacific yew(Taxus brevifolia)[J].Mycotoxon,1993,38(3):214.

[5]张玲琪,郭波,李海燕,等.长春花内生真菌的分离及其发酵产生药用成分的初步研究[J].中草药,2000,31(11):805-807.

[6]郭波,李海燕,张玲琪.一种产长春碱真菌的分离[J].云南大学学报：自然科学版,1998,20(3):214-215.

[7]付建红,刘鑫,李娟.天山花楸内生真菌的分离及其抗菌活性物质的初步研究[J].西北植物学报,2012,32(12):2537-2543.

[8]杨润亚,李艳华,柳娜娜.连翘内生真菌的分离及其抑菌活性初步研究[J].安徽农业科学,2007,35(15):4561-4563.

[9]宋萍,洪伟,吴承祯,等.雷公藤内生真菌的抑菌活性研究[J].中国农学通报,2010,26(5):262-266.

[10]田小曼,许蒙.南蛇藤内生真菌的分离及抑菌活性初探[J].西北农业学报,2011,20(11):183-187.

[11]杨明琰,田稼,马瑜,等.杜仲内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究[J].西北植物学报,2012,32(1):193-198.

[12]方中达.植病研究方法(第三版)[M].北京:农业出版社,1998:122-125.

[13]慕立义.植物化学保护研究方法[M].北京:中国农业出版社,1994:79-81.