红细胞血红蛋白释放试验的临床研究进展

李嘉欣，苏 燕

（包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014060）

包头医学院血红蛋白研究室于20世纪80年代初便创建了淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳，主要用来观察血红蛋白的电泳行为。试验时不需要制备红细胞裂解液，可直接用全血进行电泳观察，大大提高了研究效率。2007年，本研究组在进行一例轻型β-地中海贫血患者的红细胞电泳过程中偶然发现了血红蛋白（hemoglobin，Hb）再释放现象，并依此创建了血红蛋白释放试验（hemoglobin releasing test，HRT）［1-3］。红细胞内血红蛋白释放试验是将未裂解的完整红细胞加在淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳，一次通电完成电泳，此时有Hb释放出来，称为“初释放”；如果在电泳释放过程中进行“断电-再通电”，又会有Hb从原点释放出来，称为“再释放”。正常情况下，初释放时，红细胞内的大部分Hb都释放出来，残留较少；再释放时，残留Hb再次离开红细胞，出现新的Hb区带［2，4］。试验过程中，本研究组将这一技术不断发展，并应用于临床病例的研究，比较了多种疾病及手术前后血液中红细胞HRT 结果的差异，并初步探讨了其临床意义，现对其临床研究进展做一综述。

1 红细胞血红蛋白电泳再释放技术的建立与发展

根据电泳过程中停电的次数分为“单带再释放”和“多带再释放”。红细胞“单带再释放”是指在电泳过程中人为停电-再通电一次，仅释放出一个Hb区带，由于再释放Hb条带的位置可通过设定再通电的开动时间而定点，因此又称为“定点单带再释放”；“多带再释放”是指在电泳过程中人为停电-再通电多次，则释放出多个Hb区带，像梯子一样，故又称为“梯带再释放”。为了消除不同样本间上样量的差异，试验中多以碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）为内对照，通过比较释放区带与CA 区带扫描灰度的比值来定量［4］。

根据对全血或红细胞处理方法的不同分为等渗再释放、低渗再释放和等低渗全程再释放。等渗再释放是指全血中的红细胞或红细胞样本处于等渗的血浆或生理盐水中；低渗再释放是指在全血中加入不同比例的蒸馏水，使红细胞处于低渗状态，此时根据蒸馏水的比例不同，再释放差异很大；等低渗全程再释放是指同一样本在等渗和低渗条件下同时做HRT，信息量明显增加，能显示出不同疾病之间的明显差异。

根据电泳方向分为“单向再释放”和“双向再释放”。“单向再释放”是指在电泳过程中，电场方向不变；“双向再释放”是指在第一向电泳进行一段时间后，将电场方向旋转90°继续进行第二向电泳。为了区别于经典的双向电泳（等点聚焦-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳），也称之为“对角线电泳”［5-6］。这种方法避免了再释放区带与CA 的重叠，有利于定量分析。为了比较多个样本间的差异，双向电泳又分为单层（只加一个样本）、双层（加两个样本）或多层（加多个样本）。此外，根据再释放的电场方向与初释放相同或相反又可分为“前进型再释放”和“后退型再释放”。“前进型再释放”指初释放时血红蛋白向正极泳动，停电／再通电后电极方向不变，再释放出来的血红蛋白继续泳向正极方向。“后退型再释放”指停电／再通电后，阴阳极对调，这样再释放的血红蛋白就退向负极。

2 不同患者血红蛋白释放试验的比较研究

2.1 β-地中海贫血患者的血红蛋白释放试验

地中海贫血（简称地贫）是单基因遗传病，主要表现为由于珠蛋白合成障碍造成的贫血，分为α-地贫和β-地贫两种。目前诊断地贫多采用扩增受阻突变系统与聚合酶链反应相结合的检测方法。该方法准确、可靠［7］，但对试验技能要求高，费用高昂，不适用于临床地贫筛查［8］。本研究小组在对一例轻型β-地中海贫血患者血红蛋白标本进行单向Hb电泳分析时，意外发现在停电-再通电后，其Hb 释放量明显多于其他人。之后对轻型β-地中海贫血患者血红蛋白标本进一步进行了双向Hb 再释放的电泳分析，发现人为多次停电-再通电后，每次都释放出Hb，并且释放量均多于其他人，形成梯带或竹节带［1］。与此相反，球形红细胞增多症的患者HRT明显减少（待发表）。这提示，红细胞内绝大多数未与细胞膜结合Hb在第一次电泳时就释放出来，推测还有部分Hb与膜结合，在随后的停电-再通电后（再释放）才能逐步释放出来，释放量可能与疾病相关。近期试验发现［9］，不同浓度戊二醛处理红细胞后会降低Hb释放，原因与戊二醛引起红细胞膜磷脂与胞内外蛋白质发生交联有关，据此研究人员推测HRT 中再释放的Hb 可能是与细胞膜结合的Hb；另外，用不同浓度过氧化氢处理红细胞后会增加Hb再释放，这可能是由于膜脂质过氧化导致更多Hb与膜结合［10］。

2.2 普通外科患者血红蛋白释放试验

研究小组抽取18例普通外科住院患者静脉血，分别进行等渗室温HRT、等渗37 ℃HRT（即电泳前先将血液标本在37 ℃保温12h）及低渗37 ℃HRT 等3种HRT 定点释放，染色后观察血红蛋白释放情况。在等渗室温HRT 中（8例血液标本），有1例阳性；在等渗37 ℃HRT 中（10例血液标本），有3例阳性，其血液标本分别来自胆石症、肠梗阻和脾破裂患者；而在低渗37 ℃HRT 中（10例血液标本同上），有5例阳性，其血液标本除来自胆石症、肠梗阻、脾破裂患者外，还有胆总管结石和化脓性阑尾炎患者。试验结果显示各种水平HRT 的灵敏度不同：低渗37 ℃HRT 高于等渗37 ℃HRT，等渗37℃HRT 高于等渗室温HRT。灵敏度不同，可能揭示不同层次的问题。等渗室温HRT 时，多数临床标本不出现阳性，一旦释放增强，可能预示病情加重［11］。对不同患者的HRT 分析发现，同一疾病来源的血液标本并非总是阳性结果，提示HRT 的改变除与疾病相关外，可能更与其代谢异常相关。对于出现阳性结果的血液标本，是血浆中某种成分发生改变对HRT 产生了影响，还是红细胞膜成分发生改变对HRT 产生了影响，都是需要进一步深入研究的问题。

2.3 慢性肾衰竭患者的血红蛋白释放试验

慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）是各种原发性或继发性慢性肾疾患导致肾功能损害所出现的一系列症状和代谢紊乱组成的临床综合征［12］。本研究首先利用低渗HRT 五管法（使用蒸馏水对血液进行5种不同程度的稀释）研究了CRF 患者与正常人红细胞HRT 的差异。结果显示，CRF 患者低渗HRT 与正常对照组相比出现异常，当水∶血为7∶3时，差异更为明显。此外，研究者还利用低渗37 ℃HRT 一管法（水∶血为8∶2）比较了5例CRF与4例非CRF肾病患者的血红蛋白释放，结果发现CRF患者的白蛋白前移和血红蛋白释放均强于非CRF肾病患者，这可能是由于CRF 患者血中多种毒素对红细胞膜的作用［13］。为了进一步验证这种推测，研究者观察了CRF患者的血浆成分对非CRF肾病患者红细胞HRT 的影响，结果显示CRF患者的血浆成分似乎能够影响红细胞的血红蛋白释放［13］。CRF产生的毒素有3类，即水溶性物质，不与蛋白质结合的小分子物质，中分子物质和能与蛋白质结合的物质。已知中分子物质甲状旁腺素能增加红细胞内钙含量，进而影响其完整性，破坏红细胞［14］，而能与蛋白质结合的毒素是否会作用于红细胞并影响HRT，有待于进一步研究确认。

2.4 肝硬化患者血红蛋白释放试验

本研究共筛查了38例全血标本的HRT，发现一例肝功能多项异常的肝硬化伴腹水标本的HRT异常。然后研究小组利用等低渗全程试验和双层对角线电泳技术，比较了肝硬化患者和肝功正常血液标本的HRT，发现了明显不同。肝硬化患者标本的“前进”和“后退”再释放都增强。选取电泳效果最明显的等低渗标本（水∶全血为14∶6）做对角线电泳，可清楚看到Hb后退成分的存在，说明肝硬化患者红细胞中Hb的存在状态明显异常，前进再释放释放很多Hb后，后退再释放又释放出较多Hb［15］。肝硬化患者红细胞的细胞膜、形态、聚集性等都发生了很大变化，血小板参数和红细胞参数存在明显异常，血细胞破坏增加，有明显的出血倾向［16］，这些可能都会影响到HRT。肝硬化腹水是肝脏长期慢性进展性损害的结果，是肝硬化进入中晚期（失代偿期）的标志［17］。今后需要进一步比较肝硬化不同时期患者的HRT，为进一步揭开HRT 的发生机制奠定理论基础。

2.5 糖尿病患者的血红蛋白释放试验

为了研究血糖浓度对HRT 的影响，研究小组选取10例糖尿病患者的血液标本，分别做全血和红细胞的Hb梯带再释放。结果发现，全血释放几乎没有梯带，而红细胞释放有梯带且与血糖浓度相关。为了进一步研究血糖与HRT 的关系，研究小组观察了等体积50、100、500g／L 的葡萄糖溶液作用正常红细胞后的HRT。结果显示，葡萄糖能使红细胞的梯带再释放明显增强，且随着血糖浓度增大梯带再释放递增［18］。糖尿病是以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病［19］。研究表明，糖尿病病人的高糖状态能够改变正常血液环境，导致血液流变学异常、红细胞形态改变，进而导致红细胞变形能力下降［20-21］，这样也可能会影响红细胞的HRT。此外，糖尿病患者往往血脂增高，是否也会影响红细胞的HRT 还有待于进一步研究。

2.6 剖宫产前后血红蛋白释放试验

本研究选取一例剖宫产孕妇，分别于剖宫产术前、术后1、5、13d采血，然后将4 份血液标本进行多层对角线电泳，结果发现产后5d标本在HbA1前方出现联苯胺染色阳性成分。接着选取术后5d标本进行等低渗全程电泳，并对术后1d和5d的血液标本进行单向再释放。结果显示，术后5d标本出现联苯胺染色阳性成分和白蛋白前丽春红染色阳性成分［22］。推测白蛋白前的丽春红染色阳性成分应为前白蛋白。前白蛋白为肝脏合成的一种“急性期反应蛋白质”，半衰期很短，仅约1.9d。联苯胺染色阳性成分应为血红蛋白与结合珠蛋白的复合物，珠蛋白也是由肝脏合成的急性期反应蛋白，半衰期约为3.5d～4d。这两种阳性反应物质的出现，是对剖宫产手术的一种急性期反应。而是否手术不同，急性期反应蛋白出现天数不同，或其出现是否与不同患者的身体状态相关，则需要进一步深入研究。

3 展望

目前，HRT 初步的临床研究结果显示很多患者均可以出现HRT 增加，虽然没有找到其共同的规律，但可以初步确定血红蛋白再释放的改变与红细胞的改变有关。然而，影响红细胞状态的因素有很多，除了成分复杂多样的血浆外，血液流变学（包括红细胞变形性和聚集性）的改变也会影响红细胞［23］。那么，什么原因会改变血红蛋白释放？血红蛋白释放是否具有疾病特异性？这些问题都需要进一步的深入研究，从而为阐明血红蛋白释放的分子机制及其与疾病的关系奠定理论基础，为红细胞及Hb相关疾病的临床诊断和治疗提供新的依据。

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