家蚕核型多角体病毒蛋白质组学的研究进展

袁运 张和禹

（安徽农业大学生命科学学院 230036）

家蚕核型多角体病毒蛋白质组学的研究进展

袁运 张和禹

（安徽农业大学生命科学学院 230036）

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）属于杆状病毒，是一类对家蚕具有高致病性的病原体。对家蚕BmNPV的生物学特性以及新的BmNPV蛋白的鉴定和抗BmNPV的研究发现进行综述，并指出当前Bm－NPV蛋白质组学的研究阶段，为BmNPV的蛋白质组学的进步发展提供参考。

家蚕；核型多角体病毒；蛋白质组

2009年8月家蚕基因组计划的结束，标志着在物种基因组计划中家蚕跑到了前沿和领先地位，家蚕后基因组时代已经到来。作为家蚕的主要病原体之一的核型多角体病毒（NPV），自然也是目前研究的主要对象。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）病是养蚕业上最常见危害最严重的蚕病之一，以春蚕期和晚秋期发生较多。BmNPV感染会引发血液型脓病，感染后期常流出脓汁，俗称脓病，是一种急性传染病。在感染大约12～18小时后，BmNPV触发宿主家蚕基因表达和蛋白质合成的总体关闭。该病传染性极强，常呈爆发态势，难以控制，致死率很高，常造成巨大的经济损失。笔者对家蚕BmNPV的生物学特性，以及BmNPV的蛋白和抗BmNPV的研究进展进行综述，以促进对BmNPV的深入了解。

1 BmNPV的生物学特性

BmNPV为环状双链DNA病毒，属于杆状病毒科。由囊膜、衣壳和髓核组成，衣壳与髓核构成核衣壳。BmNPV有两种形式：一种为包含体衍生病毒（ODV），另一种为细胞外芽生病毒（BV）。ODV和BV的囊膜是由不同途径产生的，ODV的囊膜能结合多角体蛋白，它能保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活以及保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。ODV能特异性感染中肠上皮的柱状细胞，而BV则与血腔和体腔内许多组织细胞发生特异性作用。ODV和BV进入宿主细胞的方式也不同，ODV主要借助柱状细胞的微绒毛与病毒囊膜的膜融合作用，而BV主要是通过吸附，胞饮作用进入细胞。

核型多角体病毒的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。BV病毒产生于感染早期，仅为单个病毒粒子形式，在细胞核内产生后转移到质膜，并从质膜“出芽”而获得囊膜。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。ODV病毒产生于感染极晚期，在感染的细胞核内形成有囊膜蛋白包被的ODV，然后多角体蛋白包裹ODV，形成包含体（OB）。自然界中，BmNPV以包含体OB的形式存在。ODV病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染了OB的食物后引起感染。感染早期，复制的核衣壳会从被感染的细胞中释放出来，形成BV。感染极晚期后，新形成的核衣壳在细胞核内形成有囊膜蛋白包被的ODV，然后多角体蛋白包裹ODV形成OB。在家蚕死亡和液化后，释放在环境的OB重新启动新一轮感染。

2 BmNPV内最新的蛋白质组鉴定

在2011年，Katsuma，S等对BmNPV基因组的转录单位进行了大量的鉴定。从感染BmNPV的BmN细胞构建了全长cDNA文库。从4 679个BmNPV来源的转录单位，随机测序了11 520个克隆。发现了一系列早期或晚期启动子基序有关的新转录以及预测了非编码RNAs。这些为复杂转录调控提供了新视野。此外，在单个蛋白质研究中也取得了不少的成果［1］。

2.1 Bm134

BmNPV的ORF134［2］是苜蓿银纹夜蛾（Ac－NPV）ORF5的一个同源物。RT－PCR和Western印迹显示，Bm134的蛋白表达和转录直到感染24小时后，才被检测到，说明Bm134是一个晚期基因。Western印迹还显示，Bm134编码一个12.4kDa结构蛋白，关联ODV而不是BV。免疫荧光显示，Bm134在感染24小时后，先出现在细胞质，感染晚期转运到细胞核。在易感菌株306感染后48～72小时，检测到Bm134的转录和对应蛋白，而在抗BmNPV菌株NB中则没有。这些结论显示，Bm134是一个BmNPV的晚期基因，可能作为ODV的结构蛋白。

2.2 Bm61

BmNPV的ORF61［3］在所有鳞翅类杆状病毒都存在同源物。研究者构建了一个Bm61敲除病毒，发现Bm61缺失的杆粒，导致BV产物的缺陷。进一步电子显微镜分析显示，核衣壳没有从细胞核转运到细胞质。这表明，在BV路径，Bm61对核衣壳从细胞核到细胞质转运至关重要。

2.3 Bm71

BmNPV的ORF71［4］不是核心基因，是苜蓿银纹夜蛾（AcNPV）ORF88的一个同源物。研究者构建了一个中断的Bm71－D病毒，检测整个病毒生命周期，Bm71中断物对病毒复制和病毒的表型的影响。结果显示，Bm71－D杆粒能成功转染Bm5细胞系，产生BV。但是感染期间，BV滴度比野生型病毒低10～100倍。同时幼虫的生物测定显示，Bm71－D病毒比野生型要长7.5小时杀死家蚕幼虫。用透射电子显微镜观察到感染Bm71－D的细胞有典型的病毒基质，一束束核衣壳蛋白和多面体。这些结果显示，尽管Bm71对BmNPV的复制不是必需基因，但是对BV的产量和毒性有重要影响。因此，推测Bm71可能与控制病毒增殖的调控有关。

2.4 Bm54

BmNPV的ORF54［5］是苜蓿银纹夜蛾（Ac－NPV）ORF66的一个同源物。是病毒桥粒斑蛋白N末端超家族成员，是核衣壳蛋白从细胞核的高效出口和包含体形成的必需物。研究者构建了一个缺失Bm54的基因杆粒，用透射电子显微镜分析显示，转染缺失Bm54的病毒的细胞产生非感染性的BVs。另外电子显微镜显示，虽然Bm54的缺失不影响核衣壳蛋白的组装和释放，但是它严重影响多面体的形成。总而言之，Bm54的缺失导致非感染性的BV和缺陷的多面体。这与AcNPV66在病毒生命周期的调控截然不同。

2.5 Bm65

BmNPV的ORF65［6］是一个高度保守基因，编码一个104个氨基酸的蛋白质。用同源重组构建一个Bm65敲除杆粒。荧光显微镜显示在BmN细胞内，Bm65敲除病毒不能产生感染性的BV。另外实时定量PCR分析证实Bm65缺失不影响病毒DNA的复制。结论是Bm65对BmNPV的增殖是必需的，但是对病毒的DNA复制不是必需的。

2.6 其他蛋白

BmNPV的ORF75［7］的晶体结构是一个非典型的巯基氧化酶的伪二聚化结构，基因组序列分析显示FAD辅基关联类似人源重组静息巯基氧化酶的巯基氧化酶结构域，催化二硫键的形成，是病毒粒子组装与病毒传播所必需的。BmNPV的ORF8［8］是早期基因表达，Bm8蛋白和IE 1共定位到特定细胞核聚集点，已经证实IE 1和BmNPV hr促进Bm8的定位。另外Bm8还关联膜结合蛋白和分泌蛋白，是一个涉及多个信号通路的多功能蛋白。ORF91［9］是ODV的包膜组分，但是它的缺失没有显著影响NPV的传染性，而是延长了半数致死时间。IE 2［10］的二聚化和适当的降解对宿主内病毒的高效生长是关键步骤。但是在人工培养细胞内对BmNPV影响很小。

3 抗BmNPV病毒的最新研究

2013年为了研究家蚕对BmNPV抗性的分子机制，Chen，KP等［11］用高度抗性菌株NB和高度易感菌株306构建了一个携带BmNPV抗性的近等基因系BC8。然后用微阵列研究感染12小时后，BC8和306的中肠内基因表达的变化，鉴定了92个差异表达基因。实时荧光定量PCR分析证实，在BC8和NB的中肠相比，10个基因显著上调或者下调。5个基因（Bm123，Bm122，COP beta＇，aquaporin，glycoside hydrolases）的抗病毒作用也被证实。研究还发现丝氨酸蛋白酶与之前报道的数据不是完全一致。这些结果给BmNPV免疫反应的分子机制提供了新的视野。此外，在同时期还有很多其他关于抗BmNPV的研究。

3.1 Caspase－1和丝氨酸蛋白酶

通过蛋白质组学方法和遗传杂交［12］，总体识别在亲本家蚕NB和306以及他们F1代杂交内的蛋白的差异表达。在正交组（NB母本，306父本，F1代杂交）有53个差异蛋白，在反交组（306母本，NB父本，F1代杂交）有21个。通过GO（Gene ontology）和KEGG pathway分析显示，大部分差异蛋白定位在细胞质，并且涉及一些重要的新陈代谢。Western印迹进一步证实，Caspase－1和丝氨酸蛋白酶仅仅表达在抗BmNPV家蚕。这些数据显示，Caspase－1和丝氨酸蛋白酶在抗BmNPV感染中起到关键作用。另外［13］证实在感染BmNPV后，丝氨酸蛋白酶抑制基因（SPIs）有3个明显上调，9个明显下调。

3.2 泛素蛋白酶体系统

在细胞内蛋白的降解中泛素蛋白酶体系统［14］起到关键作用，同时在高效病毒感染也被需要。研究发现在NPV感染的BmN4细胞内，特定的蛋白酶体抑制子MG－132显著地减少了BV的产物和多角体蛋白的表达。Western印迹分析显示用MG－132处理的细胞导致延迟和/或异常调节病毒基因产物表达。感染12小时后MG－132显著地降低BV产物，然而在感染6小时后，多角体蛋白表达的抑制几乎废除。这些显示在早期感染阶段需要病毒和/或宿主蛋白质的蛋白酶体降解，实现高效多角体蛋白表达。进一步研究，BmNPV感染内泛素信号的作用，在BmNPV基因组删除泛素基因（v－ubi）。v－ubi的缺失既不影响BV产物也不影响多角体蛋白的表达。此外，western印迹也显示，泛素蛋白酶体系统内一个目标病毒蛋白IE2的降解不需要vubi。总之，宿主内的泛素蛋白酶体系统与高效的病毒增殖有关。

3.3 氯化铈（CeCl3）

小剂量的稀土能增加动物免疫能力。添加氯化铈（CeCl3）［15］到人工饲料，显著降低BmNPV引起的五龄幼虫的生长抑制和死亡率。此外，在感染BmNPV五龄幼虫内添加CeCl3明显减少脂质过氧化水平和活性氧的累积［例如：O（2）（－），H2O2，（OH）－O－center dot，和NO］，还能增加抗氧化酶的活性，包括：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸和谷胱甘肽。另外，在感染BmNPV五龄幼虫内添加CeCl3能显著促进乙酰胆碱酯酶活性和减弱诱导型一氧化氮合酶的活性。这些发现暗示添加CeCl3通过增加抗氧化能力和乙酰胆碱酯酶活性，可能减轻BmNPV感染引起的氧化损伤和家蚕的神经中毒。

3.4 二氧化钛微粒

感染BmNPV的家蚕幼虫吸收二氧化钛微粒［16］（TiO2NPs），减少活性氧和NO累积，反过来减少他们的生长抑制和死亡率。另外，TiO2NPs显著促进抗性相关基因的表达，包括那些编码超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、热激蛋白21、谷胱甘肽S转移酶O1、P53、细胞色素p302和一氧化氮合成酶。这些发现对明白添加TiO2NPs的家蚕幼虫对BmNPV的抗性机制是一个有用的补充。在养蚕方面，这些信息也提供TiO2NPs应用的一个理论基础。

3.5 其他抗病毒研究

肌动蛋白对病毒粒子转运和病毒基因表达至关重要。A3肌动蛋白［17］第一个内含子里面一个隐藏的启动子控制着一个罕见亚基的表达。不同抗性菌株的A3肌动蛋白基因的第一个内含子的大小和核苷酸组成不同。这些内含子启动子的不同结构和BmNPV抗性相关。用RT－PCR和实时定量PCR鉴定NB、306、BC8菌株内家蚕精氨酸激酶［18］（BmAK）的表达谱，结果显示在NB和BC8菌株内，BmAK的表达水平在接种后24小时增长了十倍以上，而306则没有。

4 结语

目前为止，已经从DNA、RNA、蛋白质水平对家蚕和BmNPV展开了细致的研究。鉴定了许多家蚕和BmNPV基因，在表达蛋白质组学上有很大进展，为后基因组时代奠定了坚实的基础。但是这些鉴定出来的基因都成发散存在的形式。在细胞图谱蛋白质组学上，仍然没有蛋白与蛋白或者蛋白与基因的相互作用的相关研究，没有提出类似Lac等关于基因调控的操纵子模型等，没有形成清晰的、系统的生物学机理，没有建立细胞内信号转导通路的复杂网络图。酵母双杂交实验或者荧光共振能量转移技术，今后应该常用在家蚕和BmNPV的研究中，帮助找到基因或蛋白上下游的作用因子，解释家蚕和BmNPV的详细表达机制，另外，蛋白晶体的分子结构测定，对解释分子的相互作用机制必不可少。总之，目前的研究，还处于早期的蛋白质功能测定，要形成系统的蛋白质组学，还需要更加深入系统的研究。

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