大豆多糖对环磷酰胺抗肿瘤作用的减毒增效机制研究

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(1. 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心生物安全评价研究所,国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江哈尔滨 150076; 2. 哈尔滨商业大学药学院,黑龙江哈尔滨 150076; 3. 黑龙江省农业科学院 食品加工研究所,黑龙江哈尔滨 150086)

《本草纲目》记载,大豆有涂痈肿、逐水胀、长肌肤、填骨髓等作用。从豆渣中提取的可溶性大豆多糖具有许多生物学功能,目前主要用于食品行业的研究与应用,本课题组经过研究发现大豆多糖能增强荷瘤小鼠B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫功能,调节机体免疫功能抑制肿瘤细胞的生长[1 - 2]。且大豆多糖为植物中提取的活性物质本身无毒、安全,有一定的生物学作用[3 - 5]。

环磷酰胺为临床常用的广谱抗肿瘤药物,由于其对造血系统和免疫系统的毒副作用不利于机体的继续治疗与术后的恢复[6 - 8],已有研究表明大豆多糖能通过提高机体免疫力,起到抗肿瘤作用,本研究将大豆多糖和环磷酰胺联合应用,腋下接种S180肉瘤的KM小鼠为载体,研究其对荷瘤机体免疫系统和造血系统的影响,以期既能够开发临床抗肿瘤辅助用药,又能为环磷酰胺的安全使用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

昆明种小鼠,18 ～ 22g,雌、雄各半 由长春高新医学实验动物研究中心提供;肉瘤S180购自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院;大豆多糖(纯度95%) 上海百奥特植物蛋白科技有限公司;环磷酰胺(CP) 江苏恒瑞医药有限公司;Anti - mouse - FITC - CD4单克隆抗体、Anti - mouse - PE - CD8单克隆抗体 美国ebioscience公司;小鼠肿瘤坏死因子 - αELISA 检测试剂盒 美国R&D公司等。

ALC - 110. 4型万分之一电子天平 德国Sartorius Group;LD4 - 2A型台式低速离心机 北京医用离心机厂;普通光学显微镜 Leica公司;SUNRISE 酶标仪 TECAN公司;EPICS - XL - MCL流式细胞仪 美国Beckman - Coulter公司等。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 动物分组与给药 昆明种小鼠50只,将接种8d的S180肉瘤腹水5mL,生理盐水1∶ 3稀释,0. 2mL/只接种于小鼠右前肢腋下。24h后随机分成5组,每组10只,雌雄各半。从接种第二天开始,分别腹腔注射给药,分为阴性对照组:同体积生理盐水;环磷酰胺(CP)对照组:25mg/(kg·d);大豆多糖(soybean polysaccharide,SPS)联合环磷酰胺治疗组A:CP 25mg/kg·d+SPS 50mg/kg·d、B:CP 25mg/(kg·d)+SPS 100mg/(kg·d)、C:CP 25mg/(kg·d)+SPS 200mg/(kg·d);给药量为0. 2mL/只/d,连续给药10d,停药次日处死动物。

1. 2. 2 白细胞悬液制备 停药次日,试管内加2%的乙酸0. 38mL,取0. 02mL尾静脉血,充分裂解红细胞,显微镜下观察外周血白细胞数量。

1. 2. 3 脾淋巴细胞制备 收集脾细胞于离心管中,以1500r/min离心10min。10倍体积0. 83%的NH4Cl溶液重悬,静置4min,裂解红细胞,1000r/min离心5min得白细胞液。Hanks液洗,pH为7. 2 ～ 7. 4的PBS稀释细胞成1×106个/mL。

1. 2. 4 小鼠血清中TNF - α的检测 眼球取血,1000r/min离心10min,取50μL加生物素标记抗体50μL。37℃温育1h。加亲和链酶素 - HRP 60μL,37℃温育30min。每孔加入底物A和底物B各50μL,37℃温育10min。450nm波长处测定各孔的OD值。以TNF - α标准品浓度为横坐标(X),相应的OD值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,并计算各样品中的TNF - α含量。

1. 2. 5 T淋巴细胞亚群的测定 取1×106个细胞1mL,2000r/min离心5min,分别加入荧光标记的抗小鼠CD4、CD8的单克隆抗体各100μL,同时设空白对照组和单加CD4、CD8抗体的对照组。4℃避光30min,加1mL PBS缓冲液洗涤,2000r/min离心5min,1% 多聚甲醛1mL固定30min,200目过滤,流式细胞仪检测。

2 结果与分析

2. 1 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠外周血中白细胞数量的影响

由表1可以看出,环磷酰胺显著(p<0. 01)降低了荷瘤小鼠血液中的白细胞数量,与环磷酰胺组相比,大豆多糖各剂量组白细胞数量均有极显著(p<0. 01)上升。

表1 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠外周血中白细胞数量的影响Table 1 The effect of SPS with CP on WBC of mice

注:与对照组比较*p<0. 05,* *p<0. 01;与CP比较#p<0. 05;##p<0. 01。

2. 2 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠血清中TNF - α含量的影响

TNF - α标准曲线方程:y=0. 002x+0. 118,R2=0. 993

图1 TNF - α标准曲线Fig. 1 Standard curve of TNF - α

如表2所示,与对照组相比,环磷酰胺组TNF - α水平下降,差异极显著(p<0. 01),联合用药各剂量组TNF - α含量均有所提高,其中低剂量组统计学无意义(p>0. 05),中、高剂量组有极显著性差异(p<0. 01)。与环磷酰胺组比较,低剂量组有差异(p<0. 05),中、高剂量组有极显著性差异(p<0. 01)。

2. 3 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠 T 淋巴细胞亚群的影响

表2 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠血清TNF - α含量的影响Table 2 The effect of SPS with CP on TNF - α in serum of mice with tumor

图2 大豆多糖联合环磷酰胺对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群作的影响Fig. 2 The effect of SPS with CP on and of T lymphocyte subsets注:a:对照组;b:环磷酰胺组;c:低剂量组;d:中剂量组;e:高剂量组。

3 讨论

肿瘤治疗主要根据肿瘤细胞和正常细胞不同的代谢特征、生物学特征、基因特征进行的,如果只强调治疗肿瘤的个性,忽视共性和整体原则就会影响治疗效果。如化疗及放疗药物在杀死肿瘤细胞的同时也损坏机体的免疫功能,使残存的肿瘤细胞急剧繁殖,影响治疗效果。临床观察表明恶性肿瘤的发生发展,患者对治疗措施的疗效和存活期与机体的免疫状态有密切关系。因此通过提高机体的免疫功能增强机体抗肿瘤作用的治疗方法也越来越重要。天然多糖作为免疫调节剂由于本身对机体的毒副作用小,增强机体免疫力等优点受到人们的密切关注[9]。 造血系统是体内高度活跃和高度新陈代谢的系统,由于血细胞的生成主要是在骨髓造血组织中进行,因此血细胞的变化能够一定程度的反映骨髓造血系统的变化。环磷酰胺可导致机体外周血白细胞数量减少,T细胞异常活化,使免疫功能低下,是化疗药物骨髓抑制的表现[10]。TNF - α能够引起肿瘤组织血管损伤和血栓形成,继而使肿瘤组织发生出血、坏死,并能够促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞进行杀伤。

4 结论

[1]张秀娟,刘斌,孙宇婷,等. 大豆多糖对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫机制研究[J]. 食品工业科技,2012,33(2):389 - 392.

[2]张秀娟,孙向菊,严松,等. 大豆多糖对S180荷瘤小鼠免疫调节作用的研究[J]. 药物评价研究,2012,35(6):420 - 422.

[3]廖劲松. 可溶性大豆多糖的性质及其在冷冻冷藏食品中的应用[J]. 中外食品,2010(1):51 - 52.

[4]Champ M,Guillon F. Structural and physical properties of dietary fibers,and consequences of processing on human physiology[J]. Food Research International,2000,33:233 - 245.

[5]张树和,韩羿斌,金双喜,等. 大豆多糖对双歧杆菌及人肠道菌群生长的影响[J]. 中国微生态学杂志,2008,20(2):135 - 136.

[6]王聪,王一腾,魏鑫. 环磷酰胺的临床应用现状[J]. 临床和实验医学杂志,2008,7(8):179 - 181.

[7]Adnan Ayhanci,Suzan Yaman,Varol Sahinturk,etal. Protective Effect of Seleno - L - Methionine on CP - Induced Urinary Bladder Toxicity in Rats[J]. Biol Trace Elem Res,2010(134):98 - 108.

[8]韦凤华. 环磷酰胺的临床应用研究进展[J]. 中国药事,2013,27(3):324 - 326.

[9]林俊,李萍,陈靠山. 近五年多糖抗肿瘤研究进展[J]. 中国中药杂志,2013,38(8):1116 - 1120.

[10]饶子亮,郑佳琳,黄威,等. H22实体瘤小鼠的免疫功能指标及环磷酰胺的影响[J]. 实验动物科学,2013,30(3):10 - 15.