保鲜剂对冻藏鱿鱼品质变化的影响

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(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 200090; 2. 上海海洋大学食品学院,上海 201306)

目前世界鱿鱼产量约230万t,我国每年加工的鱿鱼原料达数万吨之多。鱿鱼的可食部分占80%以上,几种远洋鱿鱼的一般成分(干基含量)大约为:粗蛋白占18% ～ 20%,粗脂肪占1. 6% ～ 2. 0%,粗灰分占1. 5% ～ 1. 7%[1]。鱿鱼富含人体必需的多种氨基酸,是一种营养保健型且风味良好的水产品资源[2]。

冷冻保藏在长期贮藏中能够极大的保持鱿鱼的品质,一方面可以降低鱿鱼蛋白内部自身的各类生化反应速率,另一方面也可以降低微生物的繁殖速率。但是由于冰晶形成和肌肉组织中水分的重结晶,蛋白在冻藏过程中不可避免地发生冷冻变性,从而导致各项理化指标的变化,最终影响产品的综合品质[3]。因此,为增加产品的附加值,提供优质鲜美的鱼品,有必要研究常用保鲜剂对鱿鱼保水性以及蛋白质变性的影响,通过添加保鲜剂以防止鱿鱼蛋白冷冻变性,提高鱿鱼的品质。目前保鲜剂对冻藏鱿鱼品质变化的研究甚少,李芳斐等[4]在壳聚糖对腌制鱿鱼防腐作用研究中指出,经过壳聚糖涂膜处理的腌制鱿鱼比未经壳聚糖涂膜处理的有一定的防腐抗菌作用。吴金龙等[5]使用从乌贼墨中提取的活性多糖对低温储藏的鱿鱼进行处理,结果表明乌贼墨多糖对冷冻鱿鱼有较好的防腐抗菌作用。本实验选择北太平洋鱿鱼,在 - 20℃下冻藏,添加D - 山梨醇、乳酸钠、三聚磷酸钠、混合磷酸盐和海藻糖,分析鱿鱼感官、持水力、盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+- ATPase活性的变化,探讨不同保鲜剂对添加剂组鱿鱼和空白组鱿鱼品质变化的影响,分析不同添加剂的效果,旨在为鱿鱼生产及加工利用提供基础数据。

表2 鱿鱼冻藏中感官评分规则Table 2 Rules of sensory evaluation on the storage of squid

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

样品 捕捞船于2012年12月在赤道公海区域捕捞,船上冻结后 - 20℃贮藏运输至实验室, - 80℃贮藏备用。

食品保鲜剂:D - 山梨醇、乳酸钠、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠和海藻糖;考马斯亮蓝 G - 250、5,5’二硫代双(2 - 硝基苯甲酸)、三羟甲基氨基甲烷、腺苷 - 5′ - 三磷酸二钠盐·二水、钼酸铵、三氯乙酸、马来酸、抗坏血酸、无水乙醇,蒸馏水、氯化钾、氯化钙、氯化镁、浓硫酸等,以上药品纯度均为AR。

JYL - 350型绞肉机 上海九阳股份有限公司;MPR - 414F型冰箱 Sanyo,日本;均质机IUL型 西班牙;高速冷冻离心机5810R型 Eppendorf,德国;质构仪TMS - Pro型 Food Technology Corporation 美国;Power Wave XS型微孔板分光光度计 美国;YP200N型电子天平 上海菁海仪器有限公司;DK_524型水浴锅 上海晋理科学仪器有限公司。

1. 2 样品处理方法和贮藏实验

对鱿鱼进行流水解冻,去头去皮去内脏,只保留胴体,切小块备用。每种保鲜剂选取3个不同浓度。保鲜剂溶液与鱿鱼比例为2∶ 1(V/m),浸泡10min后[6],沥干装袋密封,贮藏于( - 20±0. 1)℃冰箱中。共贮藏60d,每隔10d取样进行感官评价,测定鱿鱼持水力、盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+-ATPase含量。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 感官评价 由于实验量过大,实验条件的限制,各指标实验的时间紧凑,无法对所有浓度进行感官评价,仅选取由浓度Ⅱ的各保鲜剂浸泡的鱿鱼进行感官评价。参考A. Lugasi等[8]提出的感官评价方法并修改,由10名经过训练的评价员组成感官评价小组,评分规则为:最好品质(E);好品质(A);中等品质(B)和较差品质(C),评价内容包括表皮、气味、粘液、弹性等。评分细则详见表2。

表1 保鲜剂的添加量(%)Table 1 The amount of food additive(%)

1. 3. 2 持水力的测定 参考文献[9]但略作修改,利用TMS - Pro型质构仪,采用滤纸加压法(filter paper press method)进行测定。取完整肉块10. 0g置于10层滤纸上,另取10片滤纸置于其上,定压100N压5min,加压前后分别称重,记录加压前重量(W1)和加压后重量(W2),则加压条件下的持水力可以用加压失水率Xp(pressing loss)表示:

式中:Xp- 加压失水率,%;W1- 加压前鱿鱼重量,g;W2- 加压后鱿鱼重量,g。

1. 3. 3 盐溶性蛋白含量的测定 鱿鱼用搅拌机绞碎,取5g装入打浆袋中,并加入100mL 冰冷的0. 6mol/L KCl 溶液,放入均质机内匀浆2次,4℃条件下提取1. 5h,最后11000r/min下低温(4℃)离心10min,得到上清液即为实验用盐溶性蛋白溶液。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[10],用牛血清蛋白做标准曲线,标准曲线为y=0. 0055x+0. 0036(R2=0. 9993),计算结果以mg/g表示,实验重复三次。

1. 3. 4 肌动球蛋白的提取 鱿鱼绞碎后取5g,加入50mL冰冷的0. 6mol/L KCl(4℃),匀浆1次,放入4℃冰箱中提取1. 5h,然后离心(5000r/min,30min,0℃),取10mL上清液加入30mL冰冷的去离子水稀释沉淀肌动球蛋白,离心(5000r/min,20min,0℃),所得沉淀加入30mL冰冷的1. 2mol/L KCl溶液,在0℃搅拌30min,不溶部分再次离心(5000r/min,20min,0℃)[11]。所得肌动球蛋白溶液用0. 6mol/L KCl调节浓度在4 ～ 6mg/mL。所得溶液备用,以测定活性巯基和Ca2+- ATPase的含量。

1. 3. 5 活性巯基含量的测定 1mL肌动球蛋白中加入9mL 0. 2mol/L Tris - HCl 缓冲液(pH6. 8)。混合均匀后取4mL混合溶液,加入0. 4mL 0. 1% 5,5’二硫代双(2 - 硝基苯甲酸)溶液,在40℃下反应25min,溶液在412nm下测定吸光值。空白用0. 6mol/L KCl溶液代替[11 - 12]。计算结果以10-5mol/g表示,实验重复二次。

1. 3. 6 Ca2+- ATPase活性的测定 参考万建荣法[13]以及文献[14]测定Ca2+- ATPase活性。酶反应混合液组成如表3。

表3 Ca2+ - ATPase活性测定酶反应混合液组成Table 3 An enzyme reaction mixture for investigating activity of Ca2+ - ATPase

进行反应时,按表中混合液组成的配方,在试管中先将除ATP以外的其他成分混合好,将反应混合物放于25℃水浴中,待ATP溶液最后加入时,反应即开始,反应3min,加入3mL 15% TCA使反应停止,然后11000r/min离心2min,取离心液4mL加入试管中,加入3mL Tris - MgCl2缓冲液(pH7. 5),摇匀后再加入3mL定磷试剂(20% VC：3mol/L H2SO4：3%钼酸铵以等体积混合),然后在45℃恒温水浴锅中反应30min,在640nm下测其吸光度。空白组用15% TCA代替。标准曲线用预先在100℃干燥1h后置于干燥器中干燥冷却的KH2PO4,配制成0. 5mmol/L的溶液制作,标准曲线为y=0. 9193x+0. 0111(R2=0. 9998)。计算结果以1mg酶蛋白在1min内生成的无机磷酸量μmol表示,即μmol/(min·mg),实验重复三次。

1. 4 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2003进行统计分析。用SPSS 19. 0进行方差分析(p<0. 05)。

2 结果与分析

2. 1 保鲜剂对鱿鱼感官变化的影响

表4是各种保鲜剂添加浓度Ⅱ组的鱿鱼感官评分结果。从表4中可以看出,鱿鱼的感官评分指标中最先出现变化的是粘液,其次是气味,表皮和弹性的变化相当。鱿鱼的品质初始点均为最好,随着冻藏时间的延长,感官评价逐渐下降,对照组在10d以后就失去最好品质,各保鲜剂组均在20d后失去最好品质,其中海藻糖组和乳酸钠组在30d之后才失去最好品质,且海藻糖组的整体效果优于乳酸钠组。在60d时,对照组的各项指标评分均为较差,而各保鲜剂组在60d时都保持了中等品质,说明各保鲜剂均对鱿鱼的品质有提高作用。

表4 各种保鲜剂对冻藏鱿鱼的感官变化的影响Table 4 The squid sensory score of adding different additives

2. 2 保鲜剂对鱿鱼持水力变化的影响

图1分别表示了浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各保鲜剂对鱿鱼持水力的影响,鱿鱼持水力可以用失水率来表示,随着冻藏时间的延长,失水率越高,说明持水力越差,失水率越低,则持水力越强。从图中可以看出,随着冻藏时间的延长,鱿鱼的持水力越来越差。各保鲜剂组与对照组相比差异性极显著(p<0. 01),各保鲜剂对鱿鱼持水力影响程度由大到小排列分别为:海藻糖>混合磷酸盐>D - 山梨醇>乳酸钠>三聚磷酸钠,且浓度Ⅲ对持水力效果最好,浓度Ⅱ次之,浓度Ⅰ最小,海藻糖、混合磷酸盐和D - 山梨醇对提高鱿鱼持水力作用较好,分别提高了14. 83%、13. 63%、12. 27%。

图1 各种不同浓度保鲜剂对鱿鱼持水力变化的影响Fig. 1 The effects of different concentration additives on squid water retention

肉的持水力即保水性、系水性,是指肌肉在受外力作用时,如加压、加热、切碎、冷冻、解冻、腌制等加工或贮藏条件下,保持其原有水分与添加水分的能力。肉的持水力的实质是肉的蛋白质形成网状结构,单位空间以物理状态所捕获的水分量的反映。捕获水量越多,则持水力越大。肉的持水力直接关系到肉制品的出品率、嫩度和风味,所以提高肉的持水力,在肉制品生产中具有十分重要的意义[15]。混合磷酸盐是肉制品生产中使用较多的保水剂,能改变肌原纤维蛋白的热诱导凝胶流变特性,提高盐溶蛋白质热诱导凝胶保持水分和脂肪的能力,减少营养成分的损失,从而影响肉制品保水性、成品率[16]。彭亚锋等[17]指出海藻糖对生物抗脱水作用与它的玻璃态形成有关,玻璃态假说认为,当生物成分干燥时,海藻糖紧密地包住相邻的分子,形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似的碳水化合物玻璃体,其扩散系数很低,分子运动和分子变性非常微弱,能够使生物分子维持一定的空间结构。

2. 3 保鲜剂对鱿鱼盐溶性蛋白含量变化的影响

图2 各种不同浓度保鲜剂对鱿鱼盐溶性蛋白含量变化的影响Fig. 2 The effects of different concentration additives on squid salt soluble protein content

图2分别表示了浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各保鲜剂对鱿鱼盐溶性蛋白含量的影响,随着冻藏时间的增加,盐溶性蛋白含量呈下降趋势。从图中可以看出,浓度Ⅲ组D - 山梨醇、乳酸钠、三聚磷酸钠、混合磷酸盐、海藻糖的盐溶性蛋白含量分别为4. 98、6. 43、4. 68、5. 96、6. 68mg/g,各保鲜剂组与对照组相比差异性极显著(p<0. 01)。各保鲜剂对鱿鱼盐溶性蛋白含量影响程度由大到小排列分别为:海藻糖>乳酸钠>混合磷酸盐>D - 山梨醇>三聚磷酸钠,且添加浓度Ⅲ组的鱿鱼盐溶性蛋白含量最高,浓度Ⅱ次之,浓度Ⅰ最低。在整个冻藏过程中,添加浓度Ⅲ的海藻糖盐溶性蛋白含量下降了7. 91mg/g,对照组下降了12. 17mg/g,对照组的盐溶性蛋白含量减少值是浓度Ⅲ的海藻糖盐溶性蛋白含量减少值的1. 5倍,海藻糖、乳酸钠和混合磷酸盐对提高鱿鱼盐溶性蛋白含量作用较好,分别提高了4. 26、4. 01、3. 54mg/g。

冻藏引起鱼肉肌动球蛋白(主要是肌球蛋白)的打开与伸展,暴露的非极性氨基酸与邻近的类似基团引起疏水相互作用,这个过程导致了蛋白质的变性。目前国内对于淡水鱼类蛋白冷冻变性的研究主要是通过对不同条件下鱼肉中的Ca2+- ATPase活性、盐溶性蛋白含量以及巯基数量等指标的测定来分析淡水鱼蛋白质冷冻变性的程度[18]。在冻藏过程中,巯基氧化形成的二硫键会导致肌球蛋白重链的聚合,从而降低其盐溶性。海藻糖抗冻机理可能与普通的糖类相似,但是海藻糖比一般的糖类具有更优越的生化保护作用和稳定性,因为海藻糖具有高的玻璃态转变温度(Tg),包括较小的自由体积、受限制的分子流动性和在贮存中抵抗相分离和结晶的能力。乳酸钠既没有甜味也无热值,是一种GRAS食品添加剂,被广泛用作防腐剂、水分保持剂等,刘欣[19]等研究表明,海藻糖、乳酸钠的加入能较好地抑制冻藏墉鱼鱼糜蛋白的冷冻变性,表现在这2种物质加入后,冻藏编鱼鱼糜的凝胶能力得到较好的维持,盐溶性蛋白含量、Ca2+- ATPase活性和巯基含量的下降及表面疏水性的增加也得到很好的抑制,2种物质的抗冻效果比传统商业抗冻剂(蔗糖、D - 山梨醇)具有明显的优势。

2. 4 保鲜剂对鱿鱼活性巯基含量变化的影响

巯基是蛋白质分子中最具反应活性的基团。图3分别表示了浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各保鲜剂对鱿鱼活性巯基含量的影响,由图可知,随着冻藏时间的增加,鱿鱼中活性巯基含量呈下降趋势。下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纤维蛋白空间结构发生改变,使埋藏在分子内部的疏基活性基团暴露出来,导致活性巯基含量减少[20]。活性巯基的减少意味着分子间或分子内的二硫键的形成,氢键和疏水键的形成掩盖了在肌动球蛋白分子内的活性巯基。从图中可以看出,各保鲜剂对鱿鱼活性巯基含量影响程度由大到小排列分别为:海藻糖>乳酸钠>混合磷酸盐>D - 山梨醇>三聚磷酸钠,且添加浓度Ⅲ组的鱿鱼活性巯基含量最高,浓度Ⅰ最低,浓度Ⅱ介于二者之间。在整个冻藏过程中,添加浓度Ⅲ的海藻糖活性巯基含量下降了11. 75×10-5mol/g,对照组下降了18. 12×10-5mol/g,海藻糖、乳酸钠和混合磷酸盐对提高鱿鱼活性巯基含量作用较好,分别提高了6. 37×10-5、5. 27×10-5、4. 44×10-5mol/g。这些结果表明,保鲜剂的加入抑制了冻藏过程中蛋白质中巯基的氧化和二硫键的形成。

图3 各种不同浓度保鲜剂对鱿鱼活性巯基含量变化的影响Fig. 3 The effects of different concentration additives on squid active sulfydryl content

2. 5 保鲜剂对鱿鱼Ca2+ - ATPase活性变化的影响

图4分别表示了浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各保鲜剂对鱿鱼Ca2+- ATPase活性的影响,从图中可以看出,随着冻藏时间的延长,浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的Ca2+- ATPase活性均呈下降趋势。随着冷冻时间的延长,由于蛋白质分子与结合水的结合状态被破坏,蛋白质空间结构发生位移,蛋白质变性,ATPase活性部位也发生变化,导致鱼肌动球蛋白Ca2+- ATPase活性下降,所以肌动球蛋白Ca2+- ATPase活性也被广泛用来作为鱼肉蛋白变性的指标。引起冻藏过程中鱼肉肌原纤维蛋白质Ca2+- ATPase活性下降的原因目前有以下几种:Lian等认为是由于冰晶的机械作用引起的,也有很多研究认为是由pH下降引起的,还有更多的研究认为,由于巯基氧化形成二硫键导致分子聚合是ATPase活性下降的主要原因[21]。各保鲜剂对鱿鱼Ca2+- ATPase活性影响程度由大到小排列分别为:海藻糖>乳酸钠>混合磷酸盐>D - 山梨醇>三聚磷酸钠,且添加浓度Ⅲ组的鱿鱼Ca2+- ATPase活性最高,浓度Ⅰ最低,浓度Ⅱ介于二者之间,海藻糖、乳酸钠和混合磷酸盐对提高鱿鱼Ca2+- ATPase活性作用较好,分别提高了0. 72×10-2、0. 60×10-2、0. 50×10-2μmol/(min·mg)。实验结果表明保鲜剂的加入对Ca2+- ATPase活性变化有影响。

2. 6 各指标间的相关性分析

由上述结果进行进一步猜想与论证,发现除感官指标外,其他4个指标间存在较强的相关性。表5为海藻糖在浓度Ⅲ条件下各指标间的相关系数矩阵。

表5 冻藏鱿鱼在海藻糖(浓度Ⅲ)处理下各指标的相关性Table 5 Correlation among parameters of the frozen squid with trehalose at Concentration Ⅲ

图4 各种不同浓度保鲜剂对鱿鱼Ca2+ - ATPase活性变化的影响Fig. 4 The effects of different concentration additives on squid Ca2+ - ATPase activity

注:*表示显著性水平为0. 01。

由表5可知,各指标相关系数均大于0. 900以上,且都为极显著相关性。同理可知,在其他实验条件下的各指标间均存在极显著性相关性,这可能与肌动蛋白和肌球蛋白发生冷冻变性引起结构改变有关。

3 结论

D - 山梨醇、乳酸钠、三聚磷酸钠、混合磷酸盐、海藻糖对冻藏期间鱿鱼的持水力、盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+- ATPase活性均有提高作用,且浓度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组保鲜剂中,浓度Ⅲ组作用效果最好,各保鲜剂组与对照组相比差异性极显著(p<0. 01)。其中海藻糖、混合磷酸盐和D - 山梨醇对提高鱿鱼持水力作用较好,添加量分别为5%、0. 5%、1. 5%;海藻糖、乳酸钠和混合磷酸盐对提高鱿鱼盐溶性蛋白含量、活性巯基含量和Ca2+- ATPase活性作用较好,添加量分别为5%、6%、0. 5%。

海藻糖是由两个葡萄糖残基经α - 1,1 键接的非还原二糖,海藻糖结构稳定,化学惰性,无毒性,无色无臭,口感略带甜味,低热值,它具有不同于其它碳水化合物的独特的生物学性质。乳酸钠既没有甜味也无热值。且这2种保鲜剂效果均由于D - 山梨醇,避免了“高糖、高热”的消费理念,有很重要的加工意义。

本次实验对鱿鱼保鲜剂验证温度、浓度仍单一,且单一保鲜剂难以实现对鱿鱼综合品质的保持,所以保鲜剂对不同贮藏温度、添加不同浓度保鲜剂条件下鱿鱼品质的影响以及复合保鲜剂的研制需要进一步的探讨。

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