槲皮素降低TGF-β1诱导的风湿性心脏病心肌细胞I型胶原蛋白生成

王 健，吉健华，全 瑛，王医林，赵花妮

(西安市第五医院风湿科，陕西西安710000)

风湿性心脏病心肌细胞生成的胶原蛋白与心肌纤维化关系紧密，而转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)又在风湿性心脏病纤维化过程中发挥着重要作用［1］。槲皮素是一种具有多种生物学功能的多羟基黄酮类化合物，但是槲皮素对风湿性心脏病的作用不明。体外培养的风湿性心肌细胞，观察槲皮素对风心病是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料:西安交通大学第一附属医院提供左室乳头肌(瓣膜置换术的风湿性心脏病患者，研究获得西安交通大学伦理委员会审查批准书及受试者签署知情同意书);TGF-β1(Roche applied science);槲皮素来自北京化工厂产品。

1.2 方法:1)风心病患者心肌细胞培养及干预，左室乳头肌行细胞分离与原代培养。加入TGF-β1:0、2.5、5和10μg/L，孵育48 h，观察胶原蛋白合成变化。5μg/L TGF-β1干预基础上，加入 0、25、50和 100μmol/L槲皮素，观察其对TGF-β1促胶原蛋白生成影响。2)RT-PCR检测前胶原基因表达:提取细胞总 RNA，测定浓度。将0.5μg RNA合成cDNA，以GAPDH为参照基因来扩增Ⅰ型前胶原基因。PCR反应体系为25μL，反应条件为:95℃条件下变性2 min，于94 ℃，30 s，60℃，1 min，68℃，2 min条件来扩增35个循环，最后于68℃条件下延伸7 min。10μL PCR产物经2%琼脂糖电泳，经EB染色，以目的基因/内对照基因吸光度比值的均值±标准差(±s)表示检测目的基因表达。3)Western蛋白印迹30μg总蛋白行凝胶电泳，电转移至PVDF膜。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1 h。条带用薄层扫描仪扫描，软件分析各条带吸光度值，计算1型胶原蛋白相对含量。

2 结果

2.1 TGF-β1促进风湿性心脏病心肌细胞胶原蛋白合成

表1 TGF-β1促进风湿性心肌细胞1型胶原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表1 TGF-β1促进风湿性心肌细胞1型胶原蛋白生成Table 1 TGF-β1 increased the generation of type Ⅰcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 2.5μg/L;ΔP ＜0.05 compared with 5 μg/L．

group typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.41±0.08 1.16±0.06 TGF-β1(μg/L) 2.5 0.62 ±0.06* 1.65 ±0.11*5 0.86±0.11# 2.08±0.13#10 1.12±0.09Δ 2.85±0.22Δ

2.2 槲皮素抑制TGF-β1对风湿性心脏病心肌细胞胶原蛋白合成诱导作用

表2 槲皮素降低TGF-β1对风湿性心肌细胞1型胶原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

表2 槲皮素降低TGF-β1对风湿性心肌细胞1型胶原的促生成作用Table 2 Quercetol inhibited TGF-β1-induced generation of typeⅠcollagen in rheumatic cardiom yocytes(optical density correction，±s，n=6)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 25μmol/L;ΔP ＜0.05 compared with 50 μmol/L．

groups typeⅠcollagen mRNA typeⅠcollagen protein control 0.89±0.10 2.13±0.12 quercetol(μmol/L)25 0.60±0.09* 1.85±0.13*50 0.43±0.07# 1.43±0.10#100 0.30±0.05Δ 1.10±0.09Δ

3 讨论

风湿性心脏病主要病理变化就是异常胶原成分沉积所致心肌纤维化，而被增生纤维包绕的心肌细胞发生萎缩，并可伴有空泡样变［2］，因此抑制纤维化发展将有益于风湿性心脏病患者。

风湿性心脏病心肌纤维化时心肌细胞均参与了胶原蛋白的合成。TGF-β1可通过自分泌调控方式影响心肌细胞胶原蛋白生成。通过实验，我们发现TGF-β1能够剂量依赖性地增加风湿性心肌细胞I型胶原蛋白合成(表1)，这与以往研究结论是一致的，也为我们后续实验提供了基础。设法降低TGF-β1激活、释放或拮抗其对胶原合成作用，有可能为防治风心病心肌纤维化提供新的手段。槲皮素能够发挥多种生物学功能，具备抗氧化、抗癌、抗感染、降糖降压及免疫调节等作用［3］，但是其对风湿性心脏病作用研究较少。我们给与培养的心肌细胞5μg/L TGF-β1预处理，然后以此给与不同浓度的槲皮素。结果我们发现，槲皮素剂量依赖性地抑制了TGF-β1的促I型胶原蛋白生成作用(表2)。这些发现为风湿性心脏病防治提供了理论基础。

［1］Luo F，Zhuang Y，Sides MD，etal．Arsenic trioxide inhibits transforming growth factor-beta1-induced fibroblast to myofibroblast differentiation in vitro and bleomycin induced lung fibrosis in vivo［J］．Respir Res，2014，15:51．

［2］张近宝，刘维永，晏培松，等．风湿性心脏病心肌中增殖细胞核抗原和A2平滑肌肌动蛋白的表达与心功能关系［J］．中华心血管病杂志，1998;26:274-277．

［3］王晓庆，梁中琴，顾振纶，等．槲皮素抑制血管生成作用的实验研究［J］．中国药理学通报，2004，20:1161-1164．