九里香醇提物抗膝骨关节炎研究

肖月星+刘海清+李林福+吴龙火

摘要：利用Hulth手术诱导法复制大鼠膝骨关节炎模型，利用光学显微镜、组织化学法观察关节平面损害情况，通过ELISA法测定大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS含量，研究中药九里香（Murraya exotica L.）醇提物对大鼠膝骨关节炎的防治作用。结果表明，治疗组与模型组相比，九里香醇提物对关节平面具有显著的保护作用，可提高大鼠血清中SOD含量、有效降低IL-1β、TNF-α及iNOS含量。

关键词：九里香（Murraya exotica L.）；膝骨关节炎；IL-1β；TNF-α；SOD；iNOS

中图分类号：R282；R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0126-04

Studies on Anti-knee Osteoarthritis Activity of the Ethanol Extracts of Murraya exotica L.

XIAO Yue-xing，LIU Hai-qing，LI Lin-fu，WU Long-huo

（College of Pharmacy，Gannan Medical University， Ganzhou 341000，Jiangxi，China）

Abstracts： Rat knee osteoarthritis mode was established by using Hulths operational method. The joint damage was observed by light microscope and histochemical methods. The contents of IL-1β， TNF-α， SOD， and iNOS in the rat serum were determined by ELISA to study the anti-knee osteoarthritis activity of the ethanol extracts of Murraya exotica（L.）. Results showed that the treated group could significantly protect joint from damage， elevate the content of SOD， effectively reduce the contents of IL-1β， TNF-α， and iNOS.

Key words： Murraya exotica L.； knee osteoarthritis； IL-1β； TNF-α； SOD； iNOS

收稿日期：2013-03-29

基金项目：赣南医学院人才引进启动基金项目（201102）；赣南医学院校级课题（YB201012）

作者简介：肖月星（1965-），男，江西赣州人，实验师，主要从事中药药理学研究，（电话） 0797-8169634（电子信箱）8269634@163.com；通讯作者，

吴龙火（1980-），男，福建漳州人，副教授，主要从事天然产物活性成分研究，（电话）0797-8169775（电子信箱）longhw@126.com。

九里香（Murraya exotica L.）又称千里香、满山香等，为芸香科九里香属植物，具有行气止痛、活血散瘀、祛风除湿等功效。骨性关节炎（OA）是一种常见的慢性关节疾病，1995年骨性关节炎专题研究会提出OA是力学与生物因素的共同作用导致软骨细胞、胞外基质及软骨下骨三者的降解和合成失衡的结果[1，2]。软骨基质的正常结构与功能依赖于分解性代谢和合成性代谢的平衡，此平衡是通过细胞因子来调控的。IL-1β（白介素-1β）、TNF-α（肿瘤坏死因子α）及iNOS（诱导型一氧化氮合成酶）等均被认为与软骨基质的降解和破坏有非常大的关系，均被认为是分解性因子[3，4]。本试验通过复制膝骨关节炎模型，通过光学显微镜及组织化学法观察九里香醇提物对关节平面的保护，并检测大鼠血清内的IL-1β、TNF-α、SOD（超氧化物歧化酶）及iNOS的水平，以探讨九里香对骨性关节炎的分子防治机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

九里香采自福建省漳州市，经赣南医学院药学院李加林副教授鉴定为九里香，自然阴干，机械粉碎过40目筛。昆明大鼠，雄性，（200±20） g，均由江西省赣州市实验动物中心提供[合格证号：SCXK（赣）2008-0002]。

WK-200B型高速药物粉碎机，FA2004型精密电子天平，Leica组织切片机RM2235，ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。乙醇、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、甲醛、二甲苯等均为分析纯。

1.2 试验方法

取干燥九里香叶粉末1 kg，用70%乙醇进行回流提取3次，每次2 h。合并提取液并蒸去溶剂得到浸膏[5]。

1.2.1 大鼠膝骨关节炎模型 每组6只大鼠进行适应性饲养7 d后，按照Rogart等[6]的方法复制大鼠实验性骨关节炎模型。常规消毒，将大鼠以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，在无菌条件下在右膝关节内侧纵切开约2 cm，逐层分离，将膑骨向后向外翻，最大限度弯曲膝关节，显露膝关节腔。用显微器械切断前交叉韧带、内侧负韧带，完整切除内侧半月板后，逐层缝合伤口，分笼饲养，允许自由活动。术后给予青霉素10万U肌肉注射抗炎，连续注射5 d。治疗组术后进行九里香70%乙醇提取物200、100、50 mg/kg剂量灌胃，空白对照组给予相同体积的CMC-Na，连续8周。在第八周末，将大鼠麻醉后，迅速剖开胸腔进行心脏取血5 mL，静置20～30 min后，3 000 g离心10 min，取上层血清，-20 ℃冰箱保存，待检测其中的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量。取股骨内髁内侧软骨组织，用光学体式显微镜观察软骨表面的色泽及光滑情况后，迅速置于10%中性福尔马林溶液中固定以待进行病理组织学检查。

1.2.2 软骨组织切片的制备 依据参考文献[7]的方法进行大鼠软骨组织切片的制备。

1.2.3 生化指标的测定 IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS等含量严格按照ELISA试剂盒提供的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 大鼠膝骨关节软骨光学检查和组织化学检查

在第八周处死大鼠，立即打开关节腔分离组织取下股骨，进行光学显微镜观察（图1）。对照组（图1A）大鼠软骨表层光滑，呈蓝白色，光泽好，无裂纹及软化灶；关节滑膜表面光滑，无肿胀、增厚。模型组大鼠软骨表面粗糙，颜色偏白色，可见有一个较大的溃疡缺损（图1B中箭头指向），局部变薄，但未见有明显的骨赘形成；滑膜存在不同程度增生、粘连，关节液明显增多。50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治疗组（图1C）中，软骨表面糜烂较为严重，充血显著，关节滑膜表面增生肿胀，有轻度的粘连现象。100 mg/kg九里香70%乙醇提取液治疗组（图1D）中，大鼠软骨表面呈现较多的点状凹陷糜烂，充血较为明显，无裂纹及软化灶；关节滑膜表面轻度增生肿胀，未见有明显粘连现象。200 mg/kg九里香70%乙醇提取液治疗组（图1E）中，大鼠软骨表层有微点凹陷，稍微充血，无裂纹及软化灶；关节滑膜表面轻度增生肿胀，未见有明显粘连现象。

正常大鼠关节软骨的组织形态学分层按Beniinghoff法可分为4层：表层、移行层、辐射层和钙化层。组织形态学变化观察（HE染色）发现，由图2A可见，大鼠关节软骨的4层结构清晰可辨，表层细胞小而扁平，向下细胞增大并呈柱状排列，且排列整齐，潮线完整、明显。图2B的局部放大图为图2B-1，均为模型组图，可见大鼠关节软骨表面不光滑，有较大面积的溃疡缺损，表面软骨变薄，软骨细胞变少，软骨纤维增生明显，可见一些软骨细胞水肿、固缩，排列紊乱，4层结构不易分辨，潮线不完整，基质染色重度减低等。200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取液治疗组（图2C、D、E ）中可见，大鼠关节软骨表面由基本平滑至出现有凹陷状，表面软骨厚度逐渐变薄，软骨细胞数量减少，细胞肿大，排列逐渐不整齐，在50 mg/kg九里香70%乙醇提取液（图2E）中，大鼠关节软骨潮线不明显。

2.2 大鼠膝骨关节软骨的生化指标

由图3A可知，九里香70%乙醇提取物不仅对大鼠膝骨关节炎引起的SOD活性降低起到一定的抑制作用，而且可以提高大鼠体内SOD活性，并表现出剂量的依赖性。连续灌胃8周后，200、100、50 mg/kg九里香70%乙醇提取物不同剂量组大鼠血清的SOD活性分别为136.7、130.8、113.6 U/mL，而模型组的SOD活性为101.5 U/mL，低于对照组的SOD活力（104.1 U/mL）。

大鼠血清中的iNOS活性变化中（图3B），模型组大鼠体内的iNOS活性为24.7 U/mL，明显高于对照组（17.6 U/mL）。与对照组相比，200 mg/kg九里香70%乙醇提取物可显著降低大鼠体内的iNOS活性，为15.9 U/mL。而大鼠血清中的IL-1β及TNF-α（图3C、D）也表现出对九里香70%乙醇提取物剂量的依赖性，并且各处理组与对照相比差异均达显著或极显著水平。在九里香70%乙醇提取物剂量为200、100、50 mg/kg时，大鼠血清中IL-1β的含量分别为148.2、156.8、195.4 pg/mL，TNF-α的含量分别为51.4、57.9、78.3 pg/mL。而在模型组中，IL-1β、TNF-α的含量分别为239.3、127.4 pg/mL，远高于对照组（137.5、62.0 pg/mL）。

3 小结与讨论

九里香作为一种传统的中药材，具有广泛的药理学作用，现代药理学研究表明[8]，九里香具有抗生育、终止妊娠、抗菌、抗甲状腺肿大、降血糖、麻醉镇静及增强免疫功能等作用，但鲜见关于九里香抗炎镇痛及其在骨关节炎等方面的研究报道。本研究采用大鼠膝骨关节炎模型研究了九里香的抗炎镇痛作用在骨关节炎方面的应用，结果表明九里香醇提物对大鼠骨关节炎的关节平面及软骨细胞具有保护作用。

软骨细胞的正常表型表达是软骨基质保持稳定的基础，软骨细胞功能的异常是骨关节炎变化的开始和关键[9]。OA是软骨细胞合成和分解代谢活动的调节失衡，导致了细胞外基质成分的进行性丢失和软骨细胞结构与功能的破坏。这些主要是软骨细胞释放的一些细胞因子造成的。如IL-1β不仅能抑制关节软骨细胞合成特征性的基质成分Ⅱ型胶原，而且还可促进关节软骨细胞发生反分化[10]。Bulina等[11]研究发现，在OA患者的血清及滑液中均检测到高表达的IL-1β和TNF-α。利用TNF-α单克隆抗体——Infliximab，不仅可抑制OA中的TNF-α表达，而且也可抑制iNOS的合成，因此可显著缓解OA病情的发展，目前已应用于临床上OA的治疗[12]。抑制IL-1β及TNF-α的表达可促进软骨基质的合成，本研究中九里香醇提物（200、100、50 mg/kg）可显著性降低大鼠血清中IL-1β和TNF-α的含量，缓解其对软骨细胞合成基质的抑制作用。IL-1β可介导iNOS等促炎因子的合成，同时iNOS本身也是活性自由基，其可能是通过NF-κB信号途径从而影响OA软骨细胞的生理活动。200 mg/kg九里香醇提物可显著降低iNOS的表达水平，同时也提高了SOD的活性水平，可有效抑制促炎因子的破坏作用。

在光学检查中，九里香醇提物（200 mg/kg）表现出很好的保护膝关节平面的作用，这可能与其抑制了促炎因子的表达水平有关，抑制了骨关节炎的炎症免疫反应，从而有效保护了关节软骨细胞。因此，中药九里香醇提物具有抗膝骨关节炎的药理学作用，其可能的机制是与体内的IL-1β、TNF-α、SOD及iNOS的水平调节有关。

IL-1β和TNF-α又可通过NF-κB信号途径诱发软骨细胞的凋亡，在九里香醇提物治疗中剂量逐渐减少，软骨中软骨细胞也逐渐减少，这也可能与凋亡过度有关。但目前关于九里香醇提物预防OA的分子机制还不是很清楚，有待于进一步研究。

参考文献：

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（责任编辑 赵 娟）

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（责任编辑 赵 娟）

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（责任编辑 赵 娟）