L－氨基胍对体外培养退变椎间盘细胞中炎性因子水平的影响

符 俏，虞乐华

（1.重庆医科大学附属第二医院康复医学科，重庆 404100；2.海南省人民医院康复医学科，海南 海口 570311）

椎间盘组织退行性改变是脊椎疾病最基本的病理变化，是导致腰腿痛常见的原因之一。椎间盘发生退行性变时，髓核组织暴露可导致机体免疫炎性反应，导致退变的椎间盘组织中有大量免疫炎性细胞因子的表达［1－4］，炎症因子白细胞介素1（IL－1）、白细胞介素6（IL－6）和肿瘤坏死因子α（TNF－α）在椎间盘退变的发生发展过程中发挥极其重要的作用［2－5］，而一氧化氮合成酶（NOS）可以调控炎性因子表达［6］。NOS抑制剂L－氨基胍（L－AG）具有显著的消炎、抗渗出和改善微循环等药理作用，临床应用广泛，但目前少见NOS抑制剂用于椎间盘退变治疗的相关报道。基于此，本实验对L－AG的体外抑制退变椎间盘细胞炎性反应的效果进行了研究，以期为椎间盘退变的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 L－AG购于中国药品生物制品检定所；胎牛血清、达尔伯克必需基本培养基（DMEM）购于Invitrogen公司，NO、NOS试剂盒购于南京建成公司，IL－1、IL－6、TNF－α和GAPDH一抗为武汉博士德公司生产，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠IgG二抗为Promega公司生产，增强化学发光试剂盒（ECL）购于Millipore公司，Bradford法蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2 椎间盘细胞分离培养 椎间盘组织样本取自重庆医科大学附属第二医院住院病例，男性及女性各3例，年龄26～38岁，病史5～16个月。MR检查显示：突出物明显压迫神经根，标本均在手术中切取，其中L2－32例，L3－44例，椎间盘突出组织中均含不同比例的髓核和纤维环。椎间盘组织标本在无菌条件下反复冲洗数遍，以去除其表面血细胞，之后将纤维环和髓核剪成约1mm×1mm×1mm大小组织块，胰蛋白酶（0.25%）和Ⅱ型胶原酶（0.2%）交替消化，D－Hank’s液冲洗，离心，加入适量的DMEM培养液，计数后将细胞以（1～2）×105浓度接种于培养板，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，隔日更换10%胎牛血清培养液，细胞达到60%铺满瓶底后，各组中加入用DMEM培养液稀释配成的0、0.5%、1.0%、1.5%的L－AG工作液，分别为对照组和0.5%、1.0%、1.5%L－AG组，共同孵育72h，收取上清液，离心后－20℃保存待测。

1.3 分光光度法检测NO和NOS水平 按照NOS活性检测试剂盒和NO检测试剂盒说明书进行操作，检测各组椎间盘细胞中NOS活性和NO水平。

1.4 免疫印迹法检测IL－1、IL－6和TNF－α蛋白表达 分别用溶剂（对照组）和上述各浓度L－AG（药物组）处理椎间盘细胞24h后，免疫印迹法检测IL－1、IL－6和TNF－α蛋白表达水平，GAPDH作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：处理后收集细胞，4℃预冷PBS液洗3次，加入细胞蛋白提取液（50mmol·L－1This－HCl，pH＝7.4；1%Triton X－100，0.2mmol·L－1PMSF，1mmol·L－1EDTA），4℃、12000r·min－1离心10min，吸取上清，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量为每孔10μL，之后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转到PVDF膜上，封闭，不同浓度稀释一抗IL－1（1∶500）、IL－6（1∶500）、TNF－α（1∶500）或GAPDH（1∶2500）孵育，4℃过夜，HRP标记抗鼠／兔IgG二抗常温孵育1h，经ECL孵育，暗室内X光胶片成像，GelPro软件进行图像分析，原始结果为蛋白条带光密度（A）值，应用内参蛋白GAPDH进行标准化，最后以对照组为1，计算各浓度L－AG组相对于对照组的表达水平（最后结果为相对值）。每组重复6次。

1.5 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。NOS、NO、IL－1、IL－6和TNF－α检测结果以表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

2 结 果

2.1 各组椎间盘细胞中NOS活性和NO水平 与对照组比较，各浓度L－AG组NOS活性和NO水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组椎间盘细胞NOS活性和NO水平Tab.1 NOS activities and NO levels in intervertebral disc cells in various groups（n＝6，）

表1 各组椎间盘细胞NOS活性和NO水平Tab.1 NOS activities and NO levels in intervertebral disc cells in various groups（n＝6，）

＊P＜0.01compared with control group.

GroupNOS［λB／（U·mL－1）］NO［cB／（μmol·L－1）］Control 7.6±0.7156.1±9.2 L－AG 0.5%6.1±0.5＊128.3±7.2＊1.0%5.5±0.6＊116.5±6.9＊1.5%4.2±0.5＊97.7±6.6＊

2.2 各组椎间盘细胞中IL－1、IL－6和TNF－α表达水平 24h后与对照组比较，0.5%、1.0%和1.5%L－AG组椎间盘细胞中IL－1、IL－6和TNF－α表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），且L－AG作用后椎间盘细胞中IL－1、IL－6和TNF－α表达变化均呈现明显的剂量－效应关系，随L－AG浓度升高，IL－1、IL－6和TNF－α表达水平呈下降趋势。见图1及表2。

图1 各组椎间盘细胞中IL－1、IL－6和TNF－α的表达Fig.1 Expressions of IL－1，IL－6，and TNF－αin intervertebral disc cells in various groups

表2 各组椎间盘细胞中IL－1、IL－6及TNF－α表达水平Tab.2 Expression levels of IL－1，IL－6，and TNF－αin intervertbral disc cells in various groups（n＝6，）

表2 各组椎间盘细胞中IL－1、IL－6及TNF－α表达水平Tab.2 Expression levels of IL－1，IL－6，and TNF－αin intervertbral disc cells in various groups（n＝6，）

＊P＜0.01compared with control group.

GroupIL－1［ρB／（μg·L－1）］IL－6［ρB／（μg·L－1）］TNF－α［cB／（pmol·L－1）］Control 2.3±0.61.2±0.25.7±1.0 L－AG 0.5%1.8±0.3＊0.9±0.1＊4.3±0.7＊1.0%1.4±0.2＊0.7±0.1＊2.9±0.6＊1.5%0.9±0.1＊0.4±0.1＊2.2±0.4＊

3 讨 论

NOS是NO合成中的关键酶及限速酶，目前研究发现其共有3种同工酶：神经元型合成酶（nNOS）、诱导型合成酶（iNOS）及内皮型合成酶（eNOS）。iNOS通过催化L－精氨酸与氧分子反应生成NO，NO可通过自分泌或旁分泌方式作用于椎间盘细胞，参与椎间盘退行性改变发生发展过程。L－AG是胍类的NOS抑制剂，能够选择性且持续性地抑制iNOS。研究［6］表明：IL－1、IL－6和TNF－α与iNOS活性密切相关。另外，L－AG具有显著的消炎、抗渗出和改善微循环等药理作用，临床应用广泛。基于此，本研究探讨了L－AG对体外退变椎间盘组织中炎性因子水平的影响。

退变椎间盘细胞可产生IL－1、IL－6和TNF－α等多种炎性因子，炎性因子又可进一步加剧椎间盘退变的进程，二者互为因果［7］。机体中IL－1、IL－6和TNF－α介导的炎症反应是创伤、感染反应的基本部分，但在炎症免疫反应过程中炎性因子的过量释放，可导致组织损伤［8－9］。阻断炎性细胞因子的过量产生，则能阻止损害性炎症反应的发生和发展。椎间盘退行性改变主要表现为髓核蛋白多糖以及胶原强度的降低。研究［1，10］发现：炎性因子在椎间盘退行性病变中发挥着关键作用。IL－1和IL－6可由单核－巨噬细胞、纤维母细胞及软骨细胞等多种细胞合成分泌，在退变椎间盘组织中可见以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润［11－12］，通过刺激椎间盘组织金属蛋白酶（MMPs）分泌及抑制基质中蛋白多糖的产生，促进椎间盘组织退变的发生发展过程［13］。TNF－α是一种主要由激活的单核－巨噬细胞分泌的炎性细胞因子。研究［14－15］证明：TNF－α参与椎间盘退变过程，且在椎间盘退变过程中扮演关键性角色，TNF－α可导致蛋白多糖和胶原的降解，并减少其合成，进而加剧了椎间盘退变进展过程。本研究结果表明：L－AG可显著抑制退变椎间盘细胞中NOS活性与NO水平，并且还对退变椎间盘细胞中IL－1、IL－6和TNF－α等炎性介质的释放具有明显抑制作用。

综上所述，NOS抑制剂L－AG具有显著抑制退变椎间盘细胞炎性反应的作用，有临床治疗椎间盘退变潜在价值，其作用机制及在体应用效果值得深入探索。细胞因子相互之间有复杂的关系，在椎间盘退变发生发展的过程中，L－AG所致的NO水平下降是否起着最关键的主导作用仍然有待进一步深入研究。

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