野生冬虫夏草伴生细菌群落结构及多样性分析

李辉刘洋白飞荣姚粟扎西·才吉程池

（1.中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.玉树藏族自治州三江源药业有限公司，玉树 810003）

野生冬虫夏草伴生细菌群落结构及多样性分析

李辉1刘洋1白飞荣1姚粟1扎西·才吉2程池1

（1.中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.玉树藏族自治州三江源药业有限公司，玉树 810003）

采用基于PCR扩增的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，研究8种不同地理来源野生冬夏草中伴生细菌的群落结构，通过优势条带切胶测序分析，确定了不同来源冬虫夏草伴生优势细菌的种属信息，分析结果表明冬虫夏草中细菌群落多样性丰富，不同来源冬虫夏草的细菌多样性指数（H’）、丰度（D）和均匀度（J）均有所不同，且伴生细菌群落相似性与样品产地间的距离远近呈一定的正相关。本研究还发现了冬虫夏草样品中的4种共有细菌Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni，为进一步研究伴生细菌在冬虫夏草生长发育中所起的作用奠定了基础。

冬虫夏草 16S rRNA V3区 DGGE 细菌群落

冬虫夏草（Ophicordyceps sinensis）是冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科幼虫上形成的昆虫和子座的复合体，其形成和成熟过程中伴随着多种其它微生物的生长，这些微生物可产生多种功效性成分，能有效提升冬虫夏草的保健和医药功能，在野生冬虫夏草的形成过程中起着重要的作用［1，2］。

近年来，关于冬虫夏及其微环境中微生物的研究已有大量文献报道，但主要集中在真菌方面的研究。目前已经解决了冬虫夏草无性型方面的问题，并有10多种功能真菌被开发利用，如中国金孢霉（Chrysosporium sinense）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepiali）、中国拟青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾柱霉（Scytalidium hepiali）、中国弯颈霉（Tolypocladium sinense ）和蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali 等［3，4］。

然而，冬虫夏草存在着很多重要的细菌资源有待去认识和开发利用。基于目前对野生冬虫夏草中伴生细菌群落结构的研究比较缺乏的状况，本研究采用PCR-DGGE技术对不同来源的野生冬虫夏草半生细菌群落结构进行研究，旨在确定不同来源冬虫

夏草中的群落差异和共有细菌菌群，旨为冬虫夏草伴生细菌资源的挖掘与保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

样品1-7分别采集于我国冬虫夏草代表性产区青海玉树州、果洛州，四川康定、阿坝和雅拉雪山，以及云南白马雪山的高原草甸，样品8购买自玉树藏族自治州虫草交易市场（产地标注尼泊尔），详见表1。

表1 冬虫夏草样品来源表

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 取8种不同来源的冬虫夏草各一支，用无菌水冲洗后晾干，依次用70%乙醇，次氯酸钠溶液（2.5%有效Cl-），70%乙醇分别浸泡3 min，5 min，30 s，最后无菌水淋洗5-7次，在无菌条件下晾干［5］。

1.2.2 总DNA提取 取经灭菌处理后的冬虫夏草样品，按照文献［6］中的方法提取样品的总DNA。

1.2.3 16S rRNA基因V3可变区的PCR扩增 用通用引物对341f-GC和534r进行16S rRNA基因V3可变区片段的扩增。341f-GC：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（40个碱基GC夹）；534r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反 应50 μL体 系 包括10×PCR buffer（不含Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq酶（2.5 U/μL）1.2 μL，模板各1 μL，上下游引物10 mmol/L各1 μL，无菌双蒸水补齐至25 μL。PCR反应程序如下94℃预变性5 min 后进入循环，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环，72℃再次延伸10 min 。

1.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 样品的16S rRNA基因V3可变区片段的扩增产物通过DGGE分析系统进行分离。丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度为40%-60%。60℃恒温，80 V下电泳16 h，电泳完毕后用SYBR green I（1×TAE，1∶10 000）染色45 min，通过凝胶成像系统（英国UVI）分析电泳结果。

1.2.5 群落多样性分析 使用Quantity One软件对DGGE胶图进行计算；利用Shannon-Wiener多样性指数、丰度（S）和Pielou均匀度指数比较各个样品的细菌群落多样性计算。

Shannon-Wiener指数（H’）计算公式：

H=-∑PilogPi

Pielou指数（J）计算公式：

J= （1-∑Pi2）/（1-1/S）

其中，S为DGGE条带数量，Pi为第i条带灰度占该泳道总灰度的比率。

1.2.6 DGGE条带的回收、重新扩增、克隆、转化和序列测定 在波长为 354 nm 紫外线下，切取DGGE 凝胶上的主要条带，溶于 50 μL 无菌去离子水中，4℃过夜溶解。重扩增，扩增产物连接到载体pEASY-T1（TRANS），转入E.coli感受态细胞，在LB固体培养基上37℃筛选培养16 h，挑取白色转化子用含有氨苄青霉素抗性的 LB液体培养基37℃震荡培养8 h。T-载体通用引物进行菌液 PCR，经琼脂糖凝胶电泳检测后，每个样品3个阳性克隆交由生工生物工程（上海）有限公司完成测序。

1.2.7 16S rRNA基因V3可变区序列分析 所测得的16S rRNA基因V3可变区序列用DNASTAR软件去除载体序列和GC夹子后，将有效序列在NCBI上进行比对，以其中同源性最高的序列为参考序列，相似性≥97%的序列视为同一序列型（Sequence type）。

2 结果

2.1 16S rRNA基因V3可变区的PCR扩增

8种冬虫夏草样品经PCR扩增获得16S rRNA基因V3可变区的序列片段条带大小约为200 bp，条带均单一明亮（图1）。

2.2 不同来源冬虫夏草的DGGE图谱分析及细菌多样性分析

PCR扩增产物DGGE后获得8种冬虫夏草的伴

生细菌DGGE指纹图谱（图2），每条泳带代表一种冬虫夏草的细菌DGGE指纹图谱，不同位置的条带代表不同种属细菌，条带的荧光强度则反应了该细菌的丰富度，条带信号越亮，表示该种属细菌的相对数量越多。如图2表明，8种不同来源冬虫夏草的细菌群落结构存在明显差异，并呈现出不尽相同的优势菌条带，同时不同来源样品中还存在5种共有的细菌群落。

图1 16S rRNA基因V3可变区PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中的电泳图谱

8种冬虫夏草的丰度、Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数如表2，图3-图5所示。8种样品的丰度在14-25之间，平均为20，说明冬虫夏草样品含有丰富的伴生细菌。从物种多样性上来看，8种样品的多样性指数在2.36-3.103之间，具有较高的物种多样性，物种多样性变化趋势与丰度相同，来自尼泊尔的样品具有最高的细菌物种多样性和丰度。8种样品的均匀度，从趋势上看不同于物种多样性和丰富度，来源于玉树郭钦的样品具有最高的均匀度。

图2 八种不同来源冬虫夏草样品伴生细菌 DGGE 分离图谱及分析示意图

2.3 不同来源冬虫夏草的细菌群落结构相似性分析

在DGGE图谱中，不同样品的共有条带数目，可以反应不同样品之间细菌群落相似性。通过计算群落相似性系数并构建聚类树，可以得到不同来源冬虫夏草的细菌群落结构的聚类关系。从图6可以看出来源于青海治多县和果洛州样品，以及来源于玉树哈秀和郭钦的样品均聚为一个分支，相似性系数分别为80.5%和73.1%，其他样品间的相似性系数在45%-68%之间，细菌群落结构相似性与样品产地的远近具有一定的正相关性。

表2 八种不同来源冬虫夏草样品的丰度（s）、Shannon-Wiener指数和Pielou指数列表

图3 8种不同来源冬虫夏草样品的Simpson丰富度指数分析

2.4 不同来源冬虫夏草的优势细菌群落结构比较分析

为进一步研究不同冬虫夏草样品中细菌的群落组成，DGGE电泳后对其中12个优势条带进行切胶、回收、克隆、测序（表3）。测序结果经GenBank数

据库比对后，序列相似性均大于97%，比对结果显示8种冬虫夏草样品中中存在Methylovirgula、拜叶林克氏菌（Beijerinckia）、空气芽孢杆菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假单胞菌（Pseudomonas）、土地杆菌（Pedobacter）、肉食杆菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis等9个属优势细菌，分属于变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）3个类群，其中变形菌门组成最高为50%，拟杆菌门次之为33.3%，厚壁菌门占16.7%。

图4 八种不同来源冬虫夏草样品的Shannon-Wiener多样性指数分析

图5 八种不同来源冬虫夏草样品的Pielou均匀度指数分析

图6 不同冬虫夏草样品细菌群落结构相似性的聚类结果

8种不同样品中的优势细菌种类存在明显的差异（表3），但也存在一些共有的细菌种类。在所有样品中均检测到 Methylovirgula ligni、Aeribacillus pallidus、Flavihumibacter petaseus和 Pedobacter panaciterrae这4个种。

3 讨论

基于PCR扩增的变性梯度凝胶电泳（PCRDGGE）技术无需对样品中微生物进行培养，直接研究其基因指纹图谱，具有检测限低、易操作、可重复性强等优点，已广泛应用于复杂环境样品中微生物群落结构的研究［7-9］。冬虫夏草是一个十分复杂的微生态环境，对其的研究会受到很多既定因素的影响，而PCR-DGGE技术能克服传统培养方法的局限性，在分析冬虫夏草伴生细菌微生物群落结构中具有十分重要的意义。

本研究首次将PCR-DGGE技术应用于8种不同地理来源野生冬虫夏草伴生细菌群落结构研究，通过优势条带切胶测序分析，确定了不同来源冬虫夏草中伴生的优势细菌种属信息，结果表明冬虫夏草中存在丰富的细菌群落多样性，不同来源冬虫夏草的细菌多样性指数（H’）、丰度（D）和均匀度（J）均有所不同，样品之间伴生细菌群落相似性与样品产地的距离远近呈正相关，不同样品既存在细菌种类和丰度上的差异，也存在一些共有的细菌种类，其中Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和 Methylovirgula ligni是不同来源冬虫夏草中共有的伴生细菌。本研究证明，PCR-DGGE技术是一种快速有效地研究冬虫夏草伴生细菌菌群结构的技术。

与传统方法相比，PCR-DGGE技术可对未培养微生物进行检测，极大地拓展了对冬虫夏草伴生细菌多样性的研究。本研究中共检测到Methylovirgula、拜叶林克氏菌（Beijerinckia）、空气芽孢杆菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假单胞菌（Pseudomonas）、土地杆菌（Pedobacter）、肉食杆菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis9个属内的12种细菌，其中除肉食杆菌（Carnobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）已有报道［10，11］从冬虫夏草寄主肠道中分离到外，其他属均为首次检测到。

值得注意的是，本研究从8种不同来源的冬

虫夏草样品中均检测到Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni四种伴生细菌，这些细菌资源是否普遍存在于冬虫夏草中，在其形成过程中是否起着某种特定的促生作用，还需要进一步研究证实。

表3 优势条带切胶测序比对分析结果

另外，本研究基于PCR-DGGE建立了冬虫夏草伴生细菌菌群结构分析方法，但还需要进一步广泛收集不同的冬虫夏草测试样品，以获得更丰富的研究数据，并结合传统的分离纯化方法获得伴生细菌资源，为合理的开发和利用冬虫夏草伴生细菌资源打下基础。

4 结论

野生冬虫夏草伴生细菌群落多样性丰富，其样品产地间的距离远近与伴生细菌群落结构相似性呈一定的正相关，不同冬虫夏草样品中包含4种共有的伴生细菌类群，这是国内外首次利用非培养方法针对野生冬虫夏草伴生细菌群落多样性进行的研究，具有重要的理论研究与实践指导价值。

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（责任编辑 李楠）

Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Wild Ophicordyceps sinensis

Li Hui1Liu Yang1Bai Feirong1Yao Su1，2Zahi Nagi2Cheng Chi1

（1. Chinese Research Institute of Food and Fermentation Industries Chinese industrial culture collection center，Beijing 100015；2. Yushu Tibetan Autonomous Prefecture of Sanjiang Source Pharmaceutical Co Ltd，Yushu 810003）

The bacterial community structure of eight wild Ophicordyceps sinensis were investigated using PCR-DGGE.DNA sequencing was proceeded to obtain dominant bacterial population information in different samples. The result of DGGE profile showed that all the samlples contained abundant bacterial community, different samples have some differences among the Shannon-winner index, Richess and evenness, significant differences were observed between samples from distinct locations. Flavihumibacter petaseus, Sphingomonas aestuarii, Geobacillus pallidus and Methylovirgula ligni were commonly detected in all samples, which laid a foundation for further studying on the roles of bacteria during the formation process of Ophicordyceps sinensis.

Ophicordyceps sinensis 16S rRNA V3 DGGE Bacterial community

2014-03-05

国家微生物资源平台专项（NIMR2014-4），青海省科技计划项目（2012-N-142，2012-N-153），中国食品发酵工业研究院科技发展基金（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）

李辉，硕士，工程师，研究方向：微生物学；E-mail：lihui@china-cicc.org

程池，男，教授级高级工程师，博士生导师，研究方向：食品工业微生物菌种资源管理与鉴定评估；E-mail：cheng100027@163.com