巴豆醛对水稻悬浮培养细胞蛋白质表达的影响

刘悦萍郭蓓胡昊张国庆

（1.北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206；2.北京农学院植物科学与技术学院，北京 102206）

巴豆醛对水稻悬浮培养细胞蛋白质表达的影响

刘悦萍1郭蓓1胡昊2张国庆1

（1.北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206；2.北京农学院植物科学与技术学院，北京 102206）

对巴豆醛处理水稻悬浮培养细胞后蛋白质组水平的变化进行了研究，以期发现在调控水稻细胞周期活动中起重要作用的蛋白。采用双向电泳分离蛋白，PDQuest软件分析凝胶图谱确定差异蛋白点，LCQ-Fleet ion trap系统鉴定蛋白，相关数据库检索分析差异蛋白点，获得了45个差异蛋白点，经质谱鉴定和数据库分析得到26个可信蛋白，集中在胁迫反应、蛋白质命运，信号转导，物质与能量代谢和膜功能等。在这些蛋白中，小分子量热激蛋白、Skp1蛋白和26S蛋白酶，CDC48，6-磷酸葡萄糖胺乙酰基转移酶以及蔗糖合酶等蛋白已有文献报告其在植物细胞周期调控中的作用，其它一些鉴定的蛋白参与了细胞的生理活动，其与细胞周期间的相互关系需进一步的研究。巴豆醛处理影响了水稻悬浮培养细胞正常的细胞周期活动，鉴定出部分蛋白与细胞周期的调控具有密切关系，而一些与水稻细胞分化、发育相关蛋白也得到了鉴定，其在细胞周期上的作用尚未有文献报告，这些蛋白的进一步研究将有助于揭示水稻细胞周期的调控机制。

巴豆醛 水稻悬浮培养细胞 差异蛋白质组 细胞周期

细胞分化是生物体生长发育的基础。植物细胞连续的分化能力，细胞的周期活动与植物新器官的产生、植物的形态建成、生长发育乃至物种的繁衍有着密切的关系。水稻是我国重要的粮食作物，研究水稻细胞周期的调控机制对于有目的的改善水稻的农艺性状，进而提高水稻产量有着重要的意义。近年来，细胞周期的调控机制逐渐为人们所关注。在双子叶模式植物拟南芥中，细胞周期关键调节因子已经被系统分析［1-4］。细胞周期蛋白间的互作已有相关研究［5］，但在单子叶模式植物水

稻（Oryza sativa）中研究则较少。根据序列的同源性，目前在水稻基因组中已经分离到90个细胞周期关键调控基因［6］，这些基因分别属于细胞周期蛋白（cyclin）、E2F转录因子、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂（Kip-related protein，KRPs）和成视网膜瘤蛋白（Retinoblastomas，Rbs）等。蛋白质组是指由一种生物、一个基因组、一种组织或细胞表达的所有蛋白质，蛋白质组学不但可定性也可定量分析在特定条件下蛋白质水平的改变。通过蛋白质组学的方法在微生物方面鉴定了与细胞周期相关的调控因子［7］。水稻基因组测序的完成及大量信息学数据的出现为水稻蛋白质组学的研究提供了可能，目前已有相关的综述报告［8］。巴豆醛（Crotonaldehyde）是一种4碳α，β-不饱和醛酮化合物，具有毒性，其容易与许多蛋白质的残基及DNA发生反应形成共价性的螯合物，结果会导致基因突变，染色体断裂，细胞信号通路异常，严重的损害将导致细胞凋亡或坏死，正常的细胞周期及调控受到影响［9-11］。本研究采用蛋白质组学的方法，对比分析巴豆醛处理水稻悬浮培养细胞引起的蛋白质表达的变化，从蛋白质水平揭示水稻细胞周期及调控的相关因子，旨在为进一步研究水稻的生长发育机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）。

1.1.2 化学试剂和主要设备 pH3-10非线性固相IPG干胶条，IPG覆盖液，琼脂糖覆盖液，40%的丙烯酰胺，PDA（piperazine diacrylyl），pH3-10NL两性电解质，碘乙酰胺，10倍的电泳缓冲液（TGS缓冲液）和SPYRO Ruby试剂均购自Bio-Rad公司。Bio-Rad公司ReadyPrepTM2-DCleanup 试剂盒，Calbiochem公司Non-Interfering Protein AssayTM试剂盒。尿素、硫脲、CHAPS和cocktail蛋白酶抑制剂购自Sigma公司，DTT和TEMED购自Merck公司。

Bio-Rad公司的PROTEAN IEF System水平电泳系统，PROTEAN IEF XL Cell垂直电泳系统和Versa-Doc Model 4000MP IMAGING SYSTEM成像系统。

1.1.3 溶液配制 样品液A：20 mmol/L HEPES（pH7.5），1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和蛋白酶抑制剂复合物。

IPG泡涨液（裂解液）贮液：尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 4%和少量溴酚蓝，-20℃保存，用前加DTT（最终浓度为50 mmol/L）和0.5%或1.5%（V/V）的两性电解质。

平衡液贮液：尿素6 mol/L，甘油30%（V/V），Tris-HCl 37.5 mmol/L（pH8.8），SDS 5%（W/V），室温保存。平衡液A：用前向平衡液贮液中加入DTT，终浓度为2%，并加入少量的溴酚蓝。平衡液B：用前向平衡液贮液中加入碘乙酰胺，终浓度为5%，并加入少量的溴酚蓝。

凝胶贮液：29%丙烯酰胺和1% PDA，4℃保存。凝胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）。

1.2 方法

1.2.1 试验材料处理 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）悬浮培养细胞的获得参照Jenes［12］的方法，在附加2 mg/L的2，4-D的AA培养液中每周继代培养一次。

正常细胞培养24 h后，加入0.6 mol/L的巴豆醛处理3 h，其它条件与正常生长细胞一致。处理后离心除去巴豆醛的培养液，收集细胞，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 悬浮培养细胞蛋白的提取及蛋白的定量 取一定量的悬浮培养细胞，加入少量石英砂，在液氮中进行研磨，取适量的研碎粉末，装入1.5 mL的Eppendorf管中，加入样品液（20 mmol/L HEPES，pH7.5；1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA和cocktail蛋白酶抑制剂复合物），充分混合。4℃下，13 000×g离心15 min，取上清液，采用甲醇/氯仿［13］方法进行蛋白质沉淀和除盐处理，沉淀用IPG泡涨液溶解。

采用Non-Interfering Protein AssayTM试剂盒对蛋白质定量，本方法用广泛使用的沉淀剂UPPATM去除干扰，其与蛋白溶液混合后，迅速沉淀固定蛋白，显色剂与游离的铜离子结合，颜色生成与蛋白的含量成反比，以牛血清蛋白（BSA）作为参照蛋白，

在0.5-50 mg的范围内，显色与斜度一致，根据标准曲线可计算未知蛋白的含量。

1.2.3 双向电泳分析 采用PROTEAN IEF cell等电聚焦系统，17 cm胶条，每根胶条的上样液为350 μL。水化和聚焦温度为20℃，每根胶条的限制电流为50 μA，被动水化12-15 h后进行等电聚焦，应用的运行程序为：250 V，20 min；10 000 V，2.5 h；80 000 Vh。等电聚焦完成后，放在平衡液A和平衡液B中各平衡30 min，每次15 min。采用8%-16%的梯度胶进行第二向电泳，每块胶恒流16 mA条件下30 min，接着恒流24 mA条件下5-6 h。取出胶进行固定，依据Bio-Rad公司SYPRO® Ruby 染色手册进行染色。

1.2.4 凝胶图谱分析 采用VersaDoc Model 4000MP IMAGING SYSTEM进行图像采集。用PDQuest软件分析凝胶图谱，3次重复，确定差异蛋白点，然后用胶体考马斯亮蓝染色，从胶上挖取差异蛋白点。

1.2.5 质谱蛋白鉴定和数据库搜索 用枪头切取差异蛋白点，使用Roche 蛋白质组级胰蛋白酶（Trypsin）参照说明对蛋白点进行胶内酶解。ESI-MS/MS分析在匈牙利科学院蛋白质组研究中心进行，采用HPLC串联离子阱质谱仪LCQ-Fleet ion trap系统（Thermo Fisher Scientific）分析鉴定多肽。上样前，色谱柱Waters Atlantis C18、100 mm×0.75 mm（Thermo）用流动相A（Milli-QH2O+0.1%甲酸）平衡，流动相B（乙氰+0.1%甲酸）300 nL/min线性梯度洗脱。采用数据依赖模式，质谱扫描范围m/z 400-2 000，3 个信号最强的肽段被选择用于二级质谱分析，5 min内，质量相同的肽段将不再被选择用于二级质谱分析。图谱用Mascot Distiller软件（v.2.1.1.0.）识别信号峰，用Mascot软件（v.2.2.）搜索NCBI蛋白质数据库（版本是20080515）。检索参数为：胰酶消化，物种来源设置为水稻，遗漏的酶切位点为0-2个，母离子与子离子的允许误差均为±0.6 Da，固定修饰为酰胺甲基化（Carbamidomethyl），可变修饰为N末端蛋白质乙酰化、N末端谷氨酸焦性没食子酸（pyro-Glu）化和蛋氨酸氧化。单个离子得分值在55以上的蛋白是可信的。

2 结果

2.1 巴豆醛处理细胞与正常细胞图谱分析

分别提取正常和巴豆醛处理的水稻悬浮培养细胞，经过双向电泳条件的优化［14］，最后得到的电泳图谱清晰干净，纹理较少，拖尾现象不明显，蛋白点主要集中在pH4-8之间。

通过双向电泳分析巴豆醛处理对水稻悬浮培养细胞蛋白表达的影响，在忽略模糊点和不规则点的基础上，得到正常培养的水稻悬浮培养细胞的蛋白质中大约有889个蛋白点（图1-A），巴豆醛处理水稻悬浮培养细胞的蛋白质中大约有926个蛋白点（图1-B）。

应用PDQuest软件分析巴比醛处理与对照水处理表达的差异蛋白点，共得到表达差异2倍以上、并同时在3块胶上都存在差异蛋白点45个。

2.2 差异蛋白点的鉴定及蛋白鉴定结果

将得到的45个差异蛋白点经酶解处理送入LCQ-Fleet ion trap系统进行质谱鉴定。所得结果通过MASCOT搜索引擎进行分析，依据设定的检索参数，45个差异蛋白点均得到鉴定，最后将鉴定蛋白点的理论等电点及分子量与双向电泳图谱的等电点及分子量进行综合分析，确定26个可信蛋白质（图1中数字表示表达差异在2倍以上并得到鉴定的蛋白点，相同数字表示对照与处理间表达量存在差异的同一个蛋白），这些蛋白的相关表达量（图2）显示，spot1、2、3、5、6、7、8和9蛋白点仅在处理样品中特异表达，spot4是处理比对照表达量上调2倍的差异蛋白点，spot10-19、22、23和26这13个

蛋白点仅在对照中有表达，spot20、21、24和25这4个蛋白点是处理后表达量下调2倍的差异蛋白，这些差异蛋白点在双向电泳图谱上的位置，见图1。这些蛋白功能涉及防御相关蛋白、代谢相关的酶类、与蛋白质命运相关及信号转导分子相关蛋白等（表1）。不同类型的蛋白表达变化不一致，既有上调的蛋白也有下调的蛋白，说明巴豆醛处理影响水稻悬浮细胞的代谢过程，相关蛋白的表达发生不同变化，

以适应处理后的生理活动。

表1 质谱鉴定差异表达的蛋白点

图2 26个差异蛋白点的相对表达量

3 讨论

细胞周期是真核细胞自我复制，高度保守的固有机制，植物细胞周期相关基因与植物的整个生命周期密切相关，相关研究已有综述报道［15］。细胞凋亡过程是机体去除不需要的细胞，严格调控的生理过程。在人类研究上，巴豆醛处理会干扰正常的细胞周期，引起细胞的氧化胁迫，从而导致细胞凋亡或坏死［16，17］。在植物上利用巴豆醛研究外界毒性物质对细胞周期影响目前鲜见报道，本研究利用蛋白质组学的方法研究了巴豆醛处理水稻悬浮培养细胞后蛋白质组水平的变化，最后经过质谱鉴定的蛋白种类集中在胁迫反应，蛋白质命运相关蛋白，信号转导相关蛋白以及代谢相关蛋白这四大类别。

3.1 防御相关蛋白

水稻悬浮培养细胞经过巴豆醛处理后，热激蛋白家族中的3个小分子量热激蛋白诱导上调表达（spot1-3）。小分子Hsps（sHsps）是指大小为15-30 kD 的热激蛋白家族，在细胞中广泛存在，主要包含9个不同的成员：Hsp27、Hsp20、HspB3、MKBP/ HspB2、HspB8、HspB9、cvHsp、α-A crystallin和α-B crystallin。尽管这个家族成员间具有较低的氨基酸同源性，但它们之间具有相似的结构和功能［18］。目前在人类细胞上的研究表明热激蛋白与细胞凋亡密切相关，参与细胞凋亡信号通路的多个环节，一方面，热激蛋白主要起着抑制细胞凋亡、促进细胞存活的作用。另一方面，某些热激蛋白又能够作为凋亡蛋白的分子伴侣，促进细胞凋亡［19］。α-B crystallin，作为sHsps家族的成员，参与抑制细胞的凋亡，在肌原性的分化过程中，α-B crystallin被证实能够通过抑制caspase-3的活化来遏制细胞的凋亡［20］。Liu等［21］研究表明，在过氧化氢诱导的CeCl2细胞系的凋亡中，α-B crystallin能够与p53（一个促凋亡蛋白）相互作用，并抑制p53从胞质向线粒体的转移，抑制细胞的凋亡。本试验中，巴豆醛处理后α-B crystallin的表达量上调。可见，其参与了巴豆醛引起的水稻悬浮培养细胞的胁迫反应，抑制细胞凋亡，增加细胞在逆境条件下的存活。

Spot13是一种假定蛋白，目前的基因组研究结果将其归于热激蛋白家族，具体的功能未有报告。

3.2 蛋白质合成、分解相关蛋白

植物可利用多种途径来调控细胞内的蛋白水平，其中泛素-蛋白酶体系（Ubiquitin-proteasome system，UPS）是主要调控途径之一［22］，目前有报告指出UPS参与到植物生长发育的许多方面，如细胞周期，细胞调亡过程和对环境的应答反应等［23］。本试验水稻悬浮培养细胞用巴豆醛处理后，发现两个与UPS途径相关的蛋白Skp1（spot4）和26S蛋白酶（spot17）的表达下调。有Skp1蛋白参与的Skp1/cullin/F-box（SCF）促进细胞从G1期向S期的转变［24］。26S蛋

白酶体广泛分布于真核细胞中的胞质和胞核，负责细胞大多数蛋白质的降解，在几乎所有生命活动中具有关键的调控作用，主要用于降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质［25］。因为蛋白酶体降解途径对于细胞周期过程的正常运转都是必不可少的，本试验结果检测到的Skp1和26S蛋白酶的表达下调，表明巴豆醛处理导致水稻正常的细胞周期及由巴豆醛引起的细胞调亡过程均可能受到了影响，同时也说明了泛素—26S蛋白酶体系在水稻的细胞周期运转起到重要的调控作用，目前已有较多报道［22，26，27］，但具体的调节机制仍存在着争议，这将是今后继续研究的热点问题。

Spot9是 CDC48（Cell division cycle protein 48）蛋白，是细胞周期调控的一个重要因素，是真核生物AAA 蛋白家族的一个重要成员，目前研究表明，CDC48对酵母菌、拟南芥、小鼠和人［28-31］等各种生物的细胞周期起着重要的调控作用。拟南芥CDC48主要定位在核区，通过功能缺失及显性突变体的研究表明，拟南芥CDC48在细胞分裂、生长发育方面具有重要的调节作用［32］。烟草的NgCDC48定位于内质网上，并可能参与蛋白水解过程［33］。而目前也有大量文献报道，CDC48作为分子伴侣，也会影响细胞的凋亡过程［34-36］。目前在水稻中研究CDC48蛋白的功能未见有较多文献报道，本试验巴豆醛处理会导致CDC48蛋白表达量的上升，可能的原因是CDC48蛋白表达量的上升，其作为蛋白分子伴侣的功能活性增加，识别了在巴豆醛处理产生的有害的错误折叠的异常蛋白，与其它因子协同作用，分解掉异常蛋白，缩短了巴豆醛导致细胞凋亡的进程，而其真正的调控机制需要通过进一步的试验证实。

根据质谱的鉴定结果，在水稻悬浮培养细胞用巴豆醛处理后，折叠蛋白亚基3（prefoldin subunit3）的表达量上调，折叠蛋白属于一种分子伴侣蛋白，在蛋白质的从头合成过程中起着重要的作用，在本试验中的机理可能是水稻细胞响应巴豆醛会产生一些响应蛋白，折叠蛋白表达量的升高，促进响应蛋白的正确折叠。

3.3 信号转导相关蛋白

本试验鉴定出一个信号转导相关蛋白TGF-beta receptor-interacting protein1（TRIP-1），TRIP-1具有双重功能，首先TGF-β因子的信号转导途径中具有重要的作用，在植物上已证实油菜素内脂的信号转导途径中TRIP-1发挥着重要作用［37］。另外，TRIP-1与真核生物翻译起始因子eIF3的类似功能，在人和酵母中的研究表明，TRIP-1在调控发育、蛋白质翻译的起始及调控细胞周期方面具有重要的功能［38］。对拟南芥的研究表明，TRIP-1具有起始因子eIF3的功能，而TRIP-1是否具有其在类似酵母中在调控细胞分化方面的作用，目前的文献并没有明确的报道。在本试验中，当巴豆醛处理水稻悬浮培养细胞后，TRIP-1蛋白的表达量上调，这为研究其在水稻细胞周期过程的作用机制提供了一个有价值的信息，如何进行调控，调控的网络途径需要通过进一步的试验进行明确。

3.4 新陈代谢和能量相关蛋白

根据质谱鉴定分析结果，本试验共检测到6种与糖代谢相关蛋白，包括糖酵解、三羧酸循环、戊糖磷酸途径和其它的代谢途径，在所检测到的蛋白点中，spot8是6-磷酸葡萄糖胺乙酰基转移酶，是本试验中唯一个表达活性上调的糖代谢酶。在拟南芥的研究表明，该酶的活性与顶端生长区细胞的分裂与分化有关，用于细胞增殖所需的UDP-GlcNA和糖基磷脂酰肌醇锚［39，40］。在水稻的研究表明，此酶与根细胞的分化与植物激素的信号转导有关［41］。本研究中巴豆醛处理引起该酶的活性提高，根据前人研究结果，酶活性升高是促进了细胞的分化，但本试验用巴豆醛处理是影响了细胞的分化，因此推断6-磷酸葡萄糖胺乙酰基转移酶可能是细胞自我进行保护的一种方式。

其它与糖代谢相关的酶活性在巴豆醛处理后表达均下调，巴豆醛处理会导致糖代谢途径部分酶活性减弱，其中spot15是核糖激酶，其与磷酸戊糖途径有关，spot2是磷酸葡萄糖异位酶，存在于糖酵解途径中；spot21是丙酮酸脱羧酶在无氧条件下丙酮酸的去路，spot26是顺乌头酸水解酶，是糖有氧分解柠檬酸循环途径中的一个酶。上述酶活性的降低影响了细胞内糖代谢水平，细胞内的产能受到影响，从而导致细胞内能量的匮乏，影响了正常的细

胞周期活动。spot24是蔗糖合成酶，目前有多个文献［42，43］指出，蔗糖也是植物中的一个重要的“激素”信号分子，在细胞分裂过程中蔗糖是重要的调节物，尤其对于G1期的调控，本试验中巴豆醛会导致蔗糖合成途径中关键酶活性降低，可能会导致细胞内蔗糖含量下降，从而影响其对细胞周期调控。

巴豆醛处理后，糖代谢相关酶活性受到影响外，还鉴定出与蛋白质代谢途径相关的蛋白酶（spot22和spot25），与核酸代谢相关的蛋白酶（spot19）以及与次生物质代谢相关的蛋白酶（spot6），这些酶活性部分升高，部分降低，巴豆醛影响了细胞内正常的代谢活动，影响了细胞正常的分裂活动。

3.5 膜活动相关蛋白

本研究用巴豆醛处理后，膜联蛋白（annexin，spot18）的表达下调，膜联蛋白是一种广泛分布于动植物组织和细胞中依赖于钙离子的磷脂结合蛋白家族，植物膜联蛋白可参与细胞的胞吐、分泌和离子通道建立等一系列膜性活动，有关其功能及调节机制处于起步阶段，有研究表明其也参与植物逆境与发育等生理活动中［44］。本试验证实了在正常的细胞活动中，膜联蛋白参与了细胞的分化，具体的调控机制目前无太多文献报道，在水稻细胞中，膜联蛋白与细胞周期活动之间关系的研究是本试验得到的令人感兴趣的问题，需要进一步的研究。

本试验的质谱鉴定结果有一个转录因子蛋白（spot7）两个未知功能蛋白（spot10和spot16）这些蛋白在植物上的作用及其与细胞周期之间的关系需要进一步的进行研究。

4 结论

正常的水稻悬浮培养细胞经过巴豆醛处理后，共检测出45个差异蛋白点，经过质谱分析和数据库检索，鉴定出26个蛋白质身份，这些蛋白是与胁迫反应、蛋白质命运、细胞信号转导，新陈代谢和能量相关蛋白及与膜活性相关的蛋白。

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（责任编辑 马鑫）

Effects of Crotonaldehyde on the Protein Expression of Rice Suspension Cells

Liu Yueping1Guo Bei1Hu Hao2Zhang Guoqing1
（1. College of Biological Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206；2. Plant Science and Technology College，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206）

In order to study the important proteins related to cell cycle of rice, the effect of crotonaldehyde on the protein expression of suspension cell line of rice was investigated. The proteins were separated by the method of two dimensional electrophoresis, the different protein spots were analyzed by PDQuest software, and then the different protein spots were identified by LCQ-Fleet ion trap and database searching. The results showed that there were forty-five protein spots expressed differently, and twenty-six of them were identified by mass spectrometry and database analysis. The predicted function of these proteins was related to stress response, protein synthesis and processing, signal transduction, metabolism membrane function. Some of the proteins, including small molecular proteins, Skp1, 26S proteasome, cell division cycle protein 48, glucosamine-6-phosphate acetyltransferase and sucrose synthase, were related with the cell cycle process. Other identified proteins should be study further to explore its function in cell cycle of rice. The normal cell cycle activity was effected by crotonaldehyde, some of the identified proteins were related with regulation of cell cycle. Other proteins related to cell differentiation had no reports about their function to cell cycle；these proteins should be study further to explore the mechanism of cell cycle regulation.

Crotonaldehyde Rice suspension cells Different proteomics Cell cycle

2014-02-20

国家自然科学基金项目（31101509）

刘悦萍，女，博士，副教授，研究方向：果实发育的蛋白质组学；E-mail：cauping@sina.com