汉族和高加索人糖尿病肾病肾小球全基因组表达数据分析

蒋　松　施劲松　沈霞红　卢颖辉　郑春霞　鞠文君　刘志红

糖尿病肾病(DN)是西方发达国家导致慢性肾功能不全的最主要的病因。在我国，随着糖尿病发病率的不断增加，DN也已成为慢性肾脏疾病的主要病因之一。DN的主要病理形态学改变为肾小球体积增大、系膜区增宽、基质增多及K-W结节等，伴随着这些肾小球的病理改变，其基因表达的变化可能更加直接地反映了DN发生发展的分子机制。利用高通量转录组学方法获取和分析DN患者肾小球全基因组表达数据，可以更加全面地了解DN的分子发病机制。

迄今为止，仅有关于高加索和美国黑人DN患者肾小球全基因组表达谱数据的研究，尚无大样本中国汉族人群DN患者肾小球全基因组表达谱的观察研究，更缺少比较汉族同其他种族DN患者肾小球基因表达差异的研究。本文首次检测和分析了中国汉族DN患者肾小球的基因表达数据，并与高加索DN患者的数据进行比较，旨在为进一步探索DN发生发展的分子机制提供依据。

对象和方法

研究对象中国汉族DN患者：前瞻性入组2012年1～10月在南京军区南京总医院肾脏科住院，并行肾活检明确诊断为DN的患者29例。入选标准：(1)符合1997年世界卫生组织(WHO)2型糖尿病诊断标准；(2)病理形态学改变为光镜下肾小球体积增大，系膜区增生样改变，或肾小球节段硬化，少细胞结节(K-W结节)形成等；免疫荧光染色为寡免疫复合物沉积；(3)排除其他继发性肾脏疾病；(4)有完整的临床、病理及实验室检查记录。

中国汉族正常对照组：前瞻性入组2012年1～10月在南京军区南京总医院泌尿外科住院，诊断明确为肾癌的患者5例。入选标准：(1)尿常规、尿沉渣及24h尿蛋白定量阴性；(2)年龄<60岁；(3)血常规和血生化无明显异常；(4)临床无明显消瘦等恶液质表现；(5)患者的空腹血糖、餐后血糖和糖化血红蛋白水平正常。

高加索人群DN患者的入组条件与中国汉族人群DN患者入组条件一致，对照组取自活体肾脏移植手术中活体供肾的新鲜活检组织或肾脏肿瘤患者的癌旁肾脏组织。所有标本由美国密西根大学提供，来源于欧洲和美国高加索人群。分别有21例DN患者和35例对照组入选本研究。

新鲜肾组织收集DN患者肾组织收集：DN患者在签署知情同意书后，于B超定位引导下，行负压吸引法经皮肾穿刺活检术。在保证正常病理形态学检查及不增加患者活检风险的情况下，单独收集长约1～1.5 cm的肾脏皮髓交界处的新鲜组织，立即置入10 ml RNA-later保存液中于-20℃保存。

正常对照组标本收集：在肾癌患者签署知情同意书后，行患侧肾脏切除。肾脏离体后立即在远离肾脏肿瘤端切取4～5 cm3的皮髓交界处的组织块作为对照组标本，立即置入20 ml RNA-later保存液中-20℃保存。

肾小球微分离将新鲜肾组织置于玻璃平皿中，加入2 ml RNA-later，置于体式显微镜下，将目镜调整至8倍数，观察肾组织内的肾小球，利用肾小球微分离针进行肾小球微分离，剔除肾小球周围的间质组织和包囊壁，利用移液枪将微分离后的肾小球移至置有5 μl RNA-later的1.5 ml EP管中，每个EP管中置入15个微分离的肾小球，放入-80℃冰箱中保存，用于RNA提取。

RNA提取采用RNeasy micro kit(Cat#74004,QIAGEN,GmBH,Germany)并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA 抽提，抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)电泳质检合格后备用。要求RNA样品RNA完整性指数≥7.0且28S/18S≥0.7。

RNA的放大和标记RNA采用Nugen表达谱实验试剂盒，Ovation RNA amplification system kit(Cat#3100,Nugen),WB reagent(1300，Nugen)，Encore biotin module(4200，Nugen)对样品总RNA中的mRNA进行放大、标记和纯化，获得带有生物素(biotin)标记的cDNA。

芯片杂交本研究使用Affymetrix公司的Human U133 Plus 2.0芯片进行芯片杂交，该芯片可检测已知 47 000 个基因的转录本。按照芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，GeneChip® Hybridization，Wash and Stain Kit (Cat#900720， Affymetrix， Santa Clara，CA，US)，在滚动杂交炉，Hybridization Oven 645 (Cat#00-0331-220V,Affymetrix，Santa Clara，CA，US)中45℃，18h滚动杂交，杂交完成后在洗涤工作站Fluidics Station 450 (Cat#00-0079,Affymetrix,Santa Clara,CA,US)进行芯片的洗涤。

芯片扫描芯片结果采用GeneChip® Scanner 3000 (Cat#00-00212,Affymetrix，Santa Clara，CA，US)进行扫描，用Command Console Software 3.1 (Affymetrix,Santa Clara，CA，US)读 取 原 始 数 据。进行数据质量控制，质控标准为：(1)背景值 Avg Background<100；(2)管家基因 Housekeeping Controls 3’端信号与 5’端信号比值至少有一个≤3。质控合格数据进行下一步的生物信息学分析。

生物信息学分析

数据整合由于高加索人群的DN组和对照组的全基因组表达数据均来源于欧洲和美国高加索人群，且由实验室分别进行标本采集，并分为两组进行Affymetrix公司Human U133 plus 2.0芯片进行数据检测，为消除芯片表达信号的差异，我们利用批次校正(Batch Correction)对不同来源的全基因表达谱数据进行整合，随后利用主成分分析(PCA)评价整合后的高加索人群DN组和对照组的全基因组表达数据。

基因差异表达分析首先利用等级聚类方法对样本进行样本聚类和基因聚类，评价样本的相互聚类关系；使用Multiple Experiment Viewer(MEV)软件中的Significance Analysis of Microarrays(SAM)计算进行基因差异表达分析。基因的显著差异定义为Q值<0.001，倍数改变大于1.5倍。

分子信号通路分析为了对差异表达或同表型相关的基因功能进行进一步的分析，借助Affymetrix公司的NetAffy及KEGG数据库对基因进行通路分析，借助基因本体论(Gene Ontology)数据库对基因进行功能注释。

基因与临床表型相关性分析利用R软件，将所有基因与肾小球滤过率(GFR)进行相关性分析，以R绝对值(|R|)>0.6，P值<0.05作为显著相关的标准。

统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计数资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。计量资料以百分比或构成比表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结　　果

中国汉族人群和高加索人群DN患者的临床基本资料本研究共纳入了中国汉族DN患者29例，高加索DN患者21例。高加索人群肾小球基因表达数据分别来源于欧洲和美国。

高加索人群DN患者的病情表现相对较严重，其血清肌酐水平较高、eGFR相对较低。但两组蛋白尿水平和体质量指数并无明显差异(表1)。

表1　两个人种糖尿病肾病患者的基本临床数据

eGFR：估算的肾小球滤过率

欧洲和美国来源的高加索人群肾小球全基因组表达数据整合由于高加索人群DN组和对照组的数据分别来源于欧洲和美国高加索人群。为将其作为一个整体数据进行比较分析，我们需要利用对两组全基因组表达数据进行整合。

在两者数据整合之前的PCA结果显示，欧洲和美国来源的高加索人群DN患者和对照组的肾小球全基因组表达数据被分为三个不同的簇，且相互之间并无交集(图1A)。在整合之后的PCA显示，所有高加索DN患者肾小球全基因组表达数据聚集为一簇，且同对照组之间存在明显界限(图1B)。

图1　两组不同来源的高加索人群肾小球全基因组表达数据在批次校正前后的PCA结果

两个人种DN患者差异表达基因比较分析分别对中国汉族人群和高加索人群DN患者的肾小球全基因组表达数据进行差异表达分析。在中国汉族人群中，共有565个基因在DN患者和正常对照之间出现差异表达(Q<0.001，变化倍数>1.5)，其中下调139个，上调426个。在高加索人群中，共有775个基因出现差异表达(Q<0.001，变化倍数>1.5)，其中下调225个，上调550个。

对不同人种间出现差异表达的基因进行比较发现，有200个基因在中国汉族人群和高加索人群DN患者肾小球中均发生调节，且其调节方向完全一致。

进一步通路分析显示，在中国汉族人群DN患者的差异表达基因中共有48条通路富集(P<0.05)，而在高加索人群DN患者中有92条通路富集(P<0.05)。比较分析提示，有13条通路在两组不同人群中均发生调节(表2)。

两个人种DN患者同肾功能相关基因的比较分析我们对两个人群DN患者肾小球全基因组表达数据与肾脏功能指标——eGFR进行了相关性分析。在中国汉族DN患者肾小球全基因组表达数据中，与eGFR水平相关的基因共225个(FDR<0.01，|R|>0.60)，其中负相关的基因186个，正相关的基因39个。在高加索人群DN患者肾小球全基因组表达数据中，与eGFR水平相关的基因共有293个基因(P<0.05)。比较分析提示，共有55个基因在两个人群均与eGFR相关(P<0.05)(表3)。

讨　　论

DN发生和发展受到遗传背景因素的影响，不同人种之间其具体分子机制仍值得探索。利用高通量的全基因组表达谱检测和分析技术，比较分析中国汉族人群和高加索人群DN患者的肾小球内发生差异表达的基因及其分子信号通路的异同，有助于发现在不同人种间DN发生发展过程中出现共同变化的基因及潜在的分子机制；同时，揭示在不同人种中与DN患者疾病进展的临床表型相关的基因，有助于发现判断DN疾病进展的新型标志物。

表2　中国汉族和高加索糖尿病肾病患者同时出现调节的部分分子信号通路

IL:白细胞介素;NF-κB:核因子κB;EGF:表皮生长因子;CBL:小屋B系淋巴瘤;TNFR2:肿瘤坏死因子受体2

表3　中国汉族人群及高加索人群中均与eGFR明显相关的部分基因

eGFR：估算的肾小球滤过率

本研究首次利用中国汉族人群和高加索人群DN患者及正常对照组的微分离肾小球，进行了全基因组表达数据比较分析，以期发现相同的基因表达及其分子通路的调节。为避免和消除检测误差，我们首先对高加索人群的全基因组表达数据进行了批次校正。数据整合后的PCA结果显示，高加索人群DN组和对照组在表达方式上存在差异。最终本研究共纳入中国汉族人群和高加索人群的DN患者分别为29例和21例。相较于汉族DN患者，高加索DN患者的eGFR更低，肾功能损伤更重，这与欧美国家DN患者肾活检的时间点有关。但本研究的重点在于寻找两组不同人种DN患者肾小球内共同的基因表达和信号通路调节。在其病情程度不同的情况下，两组人种间仍存在的共同调节的基因和通路，更说明其在DN发生发展中的重要性。

汉族人群中与对照组比较，DN患者的肾小球内有565个基因出现差异表达；而高加索人群中，与对照组相比，有775个基因在其DN患者肾小球中出现差异表达。比较分析显示，有200个基因和13条分子通路在中国汉族人群和高加索人群DN患者的肾小球内均出现调节。

这200个共同差异表达的基因和13条共同调节的分子信号通路体现了汉族人群和高加索人群在DN发生发展过程中所存在的共同分子机制。对13条分子通路的功能分析提示，其中大一部分涉及免疫炎症反应，包括B细胞受体信号通路、树突状细胞调节TH1和TH2发育通路、白细胞介素17(IL-17)信号通路和IL-12信号通路、肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)信号通路等。免疫炎症反应在组织的损伤和修复过程中发挥了重要作用。在组织损伤时，组织释放促炎症因子，炎症细胞[如淋巴细胞、单个核细胞、树突状细胞(DCs)]顺着化学介质的浓度不同，逐渐浸润到损伤部位并被激活[1]。激活后的炎症细胞可分泌组织损伤因子，如活性氧产物(ROS)和数种生长因子[2,3]，持续导致机体的损伤。本研究发现，在不同人种DN患者肾小球内发生调节的通路多为与免疫细胞的激活和炎症介质介导相关的信号通路等，这符合慢性炎症反应的发生发展过程，也证实了慢性免疫炎症反应在DN发生发展过程中的重要作用。

TNFR2信号通路在不同人种DN患者肾小球内均出现明显调节。肿瘤坏死因子α(TNF-α)的编码基因是TNFR2信号通路中的关键基因，既往研究证实，在糖尿病小鼠模型的肾脏中，TNF-α的表达上调[4]，其作用包括促进局部的ROS产生[5-7]，增加肾脏对蛋白的通透性[7]，介导细胞毒性、凋亡和坏死等过程[8]。TNF-α可导致单个核-巨噬细胞系的聚集，通过调节血流动力学影响GFR，还可导致内皮细胞通透性的改变。在2型糖尿病的患者中，其血浆中的TNF-α的水平高于非糖尿病患者的3～4倍，而具有微量白蛋白尿的患者，其水平高于无蛋白尿的患者[9,10]，研究还证实，尿液中的TNF-α与DN疾病的进展明显相关[11]。针对这些免疫炎症反应通路，开发合适的干预药物，将是未来DN患者治疗的一个重要方向。除上述免疫炎症通路外，小屋B系淋巴瘤(CBL)介导的配体诱导的表皮生长因子(EGF)受体下调通路和过氧化物酶体增殖物通过过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)调节基因的信号通路等也出现在共同调节的基因通路列表中，这些通路在既往也被证实同DN的发生发展密切相关。

为进一步观察DN患者肾小球内基因表达与肾功能的关系，我们分别利用两个人种DN患者的肾小球全基因组表达数据与eGFR进行了相关性分析。在中国汉族人群中和高加索人群中，分别有225个和293个基因与患者eGFR的变化相关。比较发现，共55个基因在两个人种中均与eGFR密切相关。其中CRISPLD2、SPON1和LUM三种基因在中国汉族人群和高加索人群中同DN患者的eGFR的相关性均>0.6。这三种基因具有作为预测DN患者疾病进展的潜力，但是其准确性和精确度仍需要进行一步的研究验证。上述在不同人种中均与eGFR密切相关的基因参与DN肾功能调节的具体机制仍有待深入研究。其中SPON1基因，既往研究中被认为是高血压相关基因[12]，并且在盐和水的代谢中发挥作用，其编码的F-脊椎蛋白，是一种多功能蛋白，在其羧基末端含有6个TSR，在其氨基末端含有两个独特的区域。F-脊椎蛋白既往被认为是底板源性黏附蛋白，在神经系统发育过程中高表达，且在成熟神经组织中并不高表达，其仅高表达于发育或是受损的神经组织[13-15]。因此，其上调可能同感觉神经再生有关。而有研究者推论在肾脏疾病发生过程中，F-脊椎蛋白变化可调节肾脏内压力，与肾脏功能的调节相关[16]。LUM编码的蛋白表达于肾脏的内皮细胞，有研究认为其在维持肾脏滤过屏障中发挥了重要的作用，与肾脏的选择性滤过密切相关[17]。

在两个人种中与eGFR相关的基因还包括编码足细胞特异性蛋白的基因PLA2R1，其编码的磷脂酶A2受体的抗体是导致原发性膜性肾病的重要原因之一，但其在DN发生和发展中的作用仍不清楚。此外，Wnt/β-catenin通路中的多种蛋白编码基因如WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等均与DN患者的eGFR存在明显相关性，提示Wnt/β-catenin在DN疾病进展中发挥了关键作用。既往有研究显示，在DN等疾病中，足细胞内存在Wnt1上调和β-catenin激活，可抑制足细胞表面特异性蛋白nephrin的表达，介导足细胞损伤[18]。细胞足细胞内特异性的高表达Ctnnb1，可导致基膜异常、蛋白尿和肾小球损伤，而敲除足细胞内的Ctnnb1同样可导致DN表型。高表达Ctnnb1的足细胞，其活动性降低，并且与基质的黏附能力下降[19]。除足细胞外，Wnt/β-catenin通路的调节还与高糖情况下系膜细胞表型改变密切相关。因此，我们有理由相信，在糖尿病高糖背景存在的情况下，Wnt/β-catenin中的关键分子，如WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等出现调节，引起足细胞和系膜细胞的表型变化及损伤，进而影响患者肾脏功能。因此，纠正Wnt/β-catenin通路的异常调节，可能成为潜在的DN分子治疗靶点，而WNT2B、WNT4和CTNNBIP1等基因能否作为DN患者疾病进展分子标志物也值得进一步验证。

综上所述，本研究通过比较中国汉族人群和高加索人群DN患者肾小球全基因组表达数据的差异，揭示了在两个人种DN患者肾小球内发生共同调节的一系列基因及其分子信号通路，证实了免疫炎症通路在两个人种DN的发生发展中均发挥了重要作用。针对在DN患者中发生明显调节的分子信号通路，开发合适分子干预药物，可能会是未来DN患者治疗的一个重要研究方向。同时，本研究还揭示了CRISPLD2、SPON1、LUM等55个与两个人种DN患者肾功能的变化存在明显相关性，其中部分基因涉及的病理生理学过程可能参与了DN的疾病进展，但其中大部分基因在DN或其他肾脏疾病进展过程中的作用尚未被阐明，其具体分子机制尚待进一步研究。

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