糖尿病肾病的细胞治疗

黄湘华　综述　王庆文　审校

糖尿病(DM)是全球性公共卫生问题，据世界卫生组织(WHO)统计，2008年全球约有3.47亿DM患者(约占成年人的9.5%)[1]。随着DM发病率的快速升高，预计到2030年DM患者数量将倍增[2]。糖尿病肾病(DN)是DM的常见并发症，也是DM患者的主要死亡原因之一。DM控制与并发症队列研究(DCCT)表明，1型DM(T1DM)中DN的发生率约17%[3]，T2DM中DN发生率人种间差异较大，亚洲人群发生率高于高加索人[4]，中国T2DM中DN的发生率高达34.7%[5]。DN以蛋白尿及进行性的肾功能减退为主要特点，其进展速度远快于非DN患者。目前DN仍缺乏有效的治疗方法，大部分DN患者快速进展至慢性肾功能不全，甚至终末期肾病(ESRD)。在尿蛋白定量>0.5 g/d或肌酐>132.6 μmol/L的T1DM患者中，其肾小球滤过率(GFR)每年下降速度约23%±25%[6]。因此，研发DN的新型疗法显得尤为迫切。细胞治疗是近年来研究的热点，且在心脏疾病、神经系统疾病等方面展示了其治疗潜能，目前也有一些研究显示其在DN中的治疗前景，本文将综述细胞治疗在DN中的研究进展。

内皮祖细胞(EPCs)

内皮细胞损伤在DN中的发病机制维持肾脏毛细血管网的完整性至关重要，其不但是肾小球超滤的基础，也向肾小管提供氧和营养物质。与其他肾脏疾病类似，进展性DN患者在肾小球及肾小管间质都存在明显的毛细血管数量减少，并伴肾间质纤维化和肾小球足细胞病变。事实上，内皮细胞凋亡是毛细血管数量减少的关键因素[7]。内皮细胞凋亡通过直接作用(旁分泌)和间接作用(缺氧)共同促进肾脏纤维化的发展，内皮细胞凋亡可释放促纤维化的细胞因子(如结缔组织生长因子等)，诱导细胞外基质合成和肌成纤维细胞分化，同时，管周毛细血管数量减少可导致肾小管细胞氧供减少，加剧肾小管萎缩和间质纤维化[8]。而在DN体内实验中，高糖及其下游的效应分子可导致内皮细胞凋亡增加[9]。另一方面，DN足细胞病变也不是孤立存在的，足细胞和内皮细胞间的相互作用在其中起重要作用，足细胞病变可分泌一系列细胞因子(如血管内皮生长因子)，可作用于邻近的内皮细胞，而内皮细胞分泌的血栓调节蛋白减少可加剧足细胞凋亡，导致蛋白尿增多[10]。

EPCs在DN中的应用成人血管生成和修复主要依靠局部内皮细胞的增生和迁移，以形成新的血管芽。骨髓来源的EPCs在成人微血管修复和新生血管发生中起重要作用。目前，仍无特异性的细胞表面标志物确定骨髓来源的血管生成活性细胞类型，一般使用多种细胞表面标志综合判断。如CD34和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)常被用来作为EPCs的表面标志物[11]。EPCs不仅可直接生成内皮细胞，也可通过旁分泌作用生成多种细胞因子发挥作用。此外，也有学者认为部分EPCs输注体内后可能通过系统性或内分泌的作用模式起作用[12]。EPCs的上述特点使其在内皮细胞修复和缺血后的血管生成中起重要作用，目前已有研究使用EPCs治疗一些缺血性疾病，包括肾脏疾病[13]。

Yuen等[14]利用慢性肾脏病鼠模型观察EPCs是否能改善肾功能，实验动物给予来源于4周龄F344大鼠骨髓的106个EPCs，结果GFR明显提高，作用与血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗类似。与阻断肾素-血管紧张素系统不同，这种细胞治疗并未降低血压。此外，EPCs治疗也能减少尿蛋白，提高肾小球与间质的毛细血管密度，减轻肾小球硬化和小管间质的纤维化。上述研究中EPCs来源于健康供者，而DM供者的EPCs是否能取得同样的效果？研究者利用DM小鼠来源的EPCs重复了上述研究，得到相似结论，说明DM患者来源的EPCs同样具有治疗价值[13]。在上述研究之后，有学者探讨了EPCs在db/db小鼠的DN模型中的作用，尽管这些实验动物并没有GFR的下降。研究表明，不管是给予来源于非DM(db/m)还是DM(db/db)小鼠的EPCs，输注至db/db小鼠体内后，均可减轻白蛋白尿的进展和系膜基质增生的程度[15]。这些动物实验都证实了利用DM患者的自体EPCs治疗DN的潜在价值。虽然目前EPCs治疗DN的疗效尚未在临床试验中得到验证，但其对于微血管系统的修复能力已广为所知。EPCs的特性与上述细胞有相似之处，有望成为治疗DN的新方法。

间充质干细胞(MSCs)

MSCs是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的干细胞，存在于体内多种组织器官[16]。MSCs具有免疫调节能力，也可分化为中胚层的多种组织(如肌肉、血管、皮肤、骨组织等)，MSCs的这些特点使得其可应用于治疗多种疾病，包括DM各种并发症[17]。通过分泌可溶性细胞因子，MSCs可以改变树突状细胞的分泌谱，导致抗炎的细胞因子白细胞介素11(IL-11)分泌增加，同时减少γ干扰素(IFN-γ)和IL-12的分泌。通过增强抑制分子程序死亡因子1与其配体的连接，MSCs也能抑制T细胞的增生。此外，MSCs能通过增加CD4+、CD25+和FoxP3+调节T细胞数量来抑制免疫反应[18]。研究表明DM的发生发展与T调节细胞和Th17细胞扩增都有一定关系[19]，所以MSCs的治疗作用首先应归功于其分泌的免疫调节因子。此外MSCs的分化能力和自我更新能力也是其治疗DN的重要基础。

目前已有多个动物实验证实MSCs可改善DN的肾脏病变。在链脲佐菌素(STZ)诱导T1DM C57BL/6小鼠模型中，予小鼠骨髓来源的MSCs后，小鼠血糖水平可恢复正常，白蛋白尿较前减轻，肾脏组织病理改变也得到改善。另一项研究中，研究者使用STZ诱导的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷)DN小鼠模型，静脉予人源性的MSCs后得到了相似的结果，实验动物的肾脏病变明显改善[20]。这两项研究均表明静脉注射的MSCs可定植在受损的肾脏，分化为肾脏内的细胞，并调节免疫反应，从而使肾脏病变得到修复。部分人源性MSCs输注后可表达CD31分子，提示其可分化为内皮细胞。虽然MSCs可以重建DN中节段坏死的肾小球结构，但其植入后是否具有增生能力仍不明确。输注MSCs 1月后，肾脏内几乎检测不到MSCs，提示MSCs并不能在肾脏内增生，MSCs改善肾脏功能可能通过清除具细胞毒性的分子及促进新生血管生成起作用[21,22]。此外，MSCs能够分化为具有胰岛素分泌功能的β细胞，通过降低血糖和糖尿来达到治疗DN的效果。进一步的研究表明，MSCs减轻STZ诱导的DN动物模型肾脏病变的机制之一是通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MARK)信号通路，导致氧化应激和前炎症因子受抑制[23]。这些实验研究都表明MSCs移植可使DN实验动物的肾脏病变减轻，但其能否成功应用于临床仍有待进一步的研究。

诱导多能干细胞

由于器官特异性干细胞的增生分化潜能有限，而胚胎干细胞(ES)研究又涉及诸多的伦理学问题，近年来，研究的热点开始转向同样具有无限增生能力和分化潜能的诱导多能干细胞(iPS细胞)[24-26]。iPS细胞的体外培养和分化特点也可用于疾病模型的建立、药物的筛选、毒性试验、特异性细胞和组织类型的发育研究[27]。目前iPS细胞已被诱导分化为神经元细胞、心肌细胞、造血细胞和肝细胞等，但是诱导分化为肾脏细胞系的方法仍未建立[28]。Takahashi和Yamanaka[24]最早通过对体细胞基因的重编程，导入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因后，产生具有胚胎干细胞特征的新型细胞(即iPS细胞)。此后，Yu等[26]还确定了另一组可以重编程为iPS细胞的基因组合(OCT4、SOX2、NANOG和LIN28)。这些研究开启了iPS细胞研究的大门，iPS细胞研究技术进入快速发展的阶段。

目前有关从iPS细胞生成肾脏细胞系的研究屈指可数。一项研究表明，iPS细胞在给予激活素A和骨形成蛋白7(BMP7)或胶质细胞源神经营养因子(GDNF)处理后，分化产生的细胞可表达肾脏细胞系的表面标志物[29]。因为iPS细胞与ES细胞具有几乎相同的表型，而ES具有生成中胚层细胞和肾脏细胞系的能力，所以只要找到合适的方法，iPS细胞也应该具有分化为肾脏细胞的能力。ES细胞和iPS细胞都是多能干细胞，不同来源决定其具有分化为特定细胞谱系的倾向[30]。最近有研究把人肾小球系膜细胞[31]和来源于尿液的肾小管细胞[32]重编程为iPS细胞。这些iPS细胞系可能更适合于生成肾脏细胞系。

DN最终会导致蛋白尿、肾间质纤维化和ESRD，理论上也能接受iPS细胞治疗。但使用iPS细胞生成的肾小球足细胞或肾小管细胞治疗仍面临几个问题：(1)细胞治疗方式的选择，静脉注射、直接移植到肾实质或肾外部位都是可选的方法，从MSCs的研究结果看，直接静脉注射可行性更大；(2)血糖对植入细胞的影响，高糖可能降低细胞植入的效率，损伤移植细胞并导致DN复发。正如再生医学治疗其他疾病一样，iPS细胞治疗DN仍面临诸多挑战。但iPS细胞仍具有广阔的应用前景，到2011年12月，已报道了近60种疾病特异性的iPS细胞，其中包括T1DM[33]。这些细胞系既可用于了解疾病的发病机制也可提供细胞治疗的细胞来源。

胰岛干细胞

高血糖是导致DN持续进展的重要因素。与标准胰岛素治疗的DM患者相比，强化胰岛素治疗可减少微量白蛋白尿的发生[34]。胰腺移植或胰岛细胞治疗是目前能使DM患者维持血糖长期正常的唯一治疗方法，且无低血糖的风险[35]。目前胰腺移植或胰肾联合移植已成为T1DM治疗的重要手段，全球已有超过23 000例的胰腺移植病例[36]。虽然胰腺移植使血糖得到了有效的控制，但术后免疫抑制剂的使用则会造成肾毒性，从长期结果来看，与DM相关的肾脏形态学改变可得到有效改善，但是移植与非移植患者的GFR下降并无明显差别。对于GFR< 80 ml/(min·1.73m2)的患者，胰腺移植是GFR下降的独立危险因素，故移植前应考虑肾脏并发症情况，选择合适的受者[37]。

胰岛干细胞是DM治疗研究热点之一。研究表明，胰管是β细胞的前体细胞存在的主要部位。胰管祖细胞的分化保持了胰岛细胞的稳定及更新。研究者已经从成人胰岛及胰岛来源的细胞中得到多能前体细胞，可分化为具有β细胞功能的细胞[38]。Ngn-3是人类胰腺内分泌功能发育过程的关键因子，而胰管细胞可以表达这种因子，并转化为具有胰岛素分泌能力的细胞。此外，以胰管和腺泡细胞混合，辅以上皮生长因子和胃泌素，可获得新生的胰岛β细胞并增加有功能的β细胞数量。基于上述的研究成果，胰岛干细胞可能成为胰岛生成的一种细胞来源，为DM及其并发症(如DN)的治疗提供新的途径[39]。

小结：DN是导致ESRD的重要原因之一，目前缺乏有效的治疗手段，亟待研究新型的治疗方法。细胞治疗是继药物、手术之后的第三种治疗手段，已经在血液疾病、自身免疫病等多种疾病中展示出良好的治疗效果。目前的研究表明EPCs、诱导多能干细胞、MSCs及胰岛细胞移植在DN中均有潜在的应用价值，但是有关干细胞治疗的研究均处于临床前的阶段，真正应用于临床仍有很多问题尚待解决。

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