动脉粥样硬化动物模型的研究进展

王凤，章怡祎，刘萍

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)严重危害人类生命健康，是导致人类死亡的“头号杀手”。有关AS的确切病因尚不清楚。因此，国内外学者从不同侧面提出诸多学说，如脂质浸润学说、损伤-反应学说和炎症学说等，但均不能全面解释AS的发生与发展。鉴于AS是多因素共同作用的结果，对AS病因病机的探讨、治疗对策的探索和防治药物的研发，成为医学研究的重要课题。而展开此项研究的重要工具就是研究并建立可靠的AS动物模型。作者就各种模型的研究现状及评价作一综述，以期对深入研究和指导临床能有所获益。

1 AS模型的研究概况

1.1 AS模型动物的选择

1.1.1 AS模型大鼠 AS模型大鼠应用较广，是因其饲养方便、获取简易、生存能力强且手术耐受性好，但是其体形及动脉小，无胆囊，对外源性胆固醇吸收率低，具有抗实验性AS特性等不利因素[1]。连伟光等[2]认为,HFJ大鼠AS模型特点更为显著，可为AS研究提供一种新的实验动物品系。

1.1.2 AS模型小鼠 利用小白鼠制造实验模型取血不便、动态观察较难，所以很少采用。随着转基因技术和基因敲除技术的出现，已成功研制出不少新的AS模型小鼠，如转载脂蛋白E3(Leiden)基因小鼠模型和载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠模型[3]，之后产生了目前应用最为广泛的ApoE缺陷株(ApoE-/-)和LDL受体缺陷株(LDL-R-/-)模型小鼠。这类小鼠可自发形成动脉粥样病变，如同时配合高脂饮食，能够产生易损斑块或形成血栓。

鼠模型的病变具有两大优势：首先，病变的形态与人类产生的十分相似；其次，斑块的破裂位置也与人类相似，同样是发生在斑块的肩部。然而，与人类不同的是，鼠模型的斑块破裂处缺乏纤维蛋白和血栓形成。由此可见此类模型需要进一步改进，以更符合人类病变的特征。

1.1.3 AS模型兔 兔为最早用于复制AS模型的动物，主要有新西兰家兔(NZW兔)、日本大耳白兔(JW兔)等。兔对外源性胆固醇吸收率高，对高血脂清除力低，采用多种方法联合，易成模，且不同的饮食结构可产生不同类型的AS斑块。此外，兔的体型大小非常适合制作动物模型，饲养方便，费用也能够承受，至今仍然被广泛应用。但是兔子是草食性动物，不易自发性产生AS，而且建模时的高脂饲养组方、喂饲方法、所用时间不同，使其病变特点亦与人体不同。同时，兔抵抗力差，易继发感染而死亡，并且用药量大，形成典型的AS病理学改变需8～12周[1]。另外，渡边兔(WHHL兔)和圣·托马斯兔是研究高胆固酵血症和AS常用的两个自发性动物模型。

1.1.4 AS模型小型猪 AS模型小型猪是现今较理想而且易得的研究AS的工具之一。虽然购买和饲养小型猪的费用较高，但是小型猪的饮食结构以及心血管系统在解剖、生理等方面近似于人类，即使在正常饮食时小型猪也会产生AS，且随着饲养时间增长，还可自发产生AS[4]。

1.1.5 其它动脉粥样硬化模型 除此之外，还有使用鸽、鹌鹑、犬、猴子等动物。如李润琴等[5]使用高脂饲料喂养鹌鹑发现，大多数动物动脉发生了粥样变，出现典型的AS的病理形态学改变，故也较多用于抗AS药物的评价。给予猴类高胆固醇饮食，可以发展成与人类相同的AS病变，但其价格昂贵，而且多是受保护的物种，因此，目前一般只限于AS复杂因素如精神压力的研究[6]。对犬进行高胆固醇喂养通常不发生动脉硬化，因此较难模仿人类的AS狭窄模型[7]。

1.2 复制AS模型的概况

1.2.1 饲喂法 此法是AS研究中最常用的造模方法之一，已被众多的研究者所接受。鉴于脂质代谢的差异，所用饲料是在基础饲料、胆固醇、蛋黄、猪油的基础上，根据实验目的，采用不同配方组成。李然等[8]采用不同饲料结合L-蛋氨酸配方，研究大鼠高脂高同型半胱氨酸(HHcy)血症模型。张璞璞等[9]研究采用高蛋氨酸饲料喂养结合球囊损伤腹主动脉的方法，建立了兔高同型半胱氨酸血症及其所致AS模型。此外，还有采用高脂饲料结合丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)成功复制AS动物模型。PTU通过对甲状腺功能的抑制，从而降低兔的新陈代谢，减少脂类消耗，促进脂类底物的利用，从而提高脂肪组织对甘油三酯的摄取能力。但PTU应用于AS模型大鼠复制中对大鼠心肌细胞产生较明显的损伤，所以，对应用PTU有待进一步探讨[10]。

1.2.2 灌胃法 王茁伉等[11]选用雄性日本大耳白兔，采用脂肪乳剂灌胃法(脂肪乳剂按胆固醇∶猪油∶蛋黄粉=1∶5∶4配制)加同步氮气损伤(历时5 min，150 ml·min-1氮气流损伤血管内皮)，有效地建立了兔颈动脉粥样硬化模型。连伟光等[2]采用高脂饮食、免疫损伤并结合维生素D3灌胃的方法，成功建立了HFJ大鼠和Wistar大鼠AS模型。吴楠等[12]采用维生素D3腹腔注射+高脂饲料(不含丙基硫氧嘧啶)+丙基硫氧嘧啶灌胃的方法，可建立典型的动脉粥样硬化模型，与维生素D3腹腔注射+高脂饲料(含丙基硫氧嘧啶)进食组相比较，成模率高，死亡率低。

1.2.3 注射法 大量研究表明，人类动脉硬化的血管壁中含有大量的钙，其含量与冠心病的病变程度呈正相关。Bennani-Kabchi等[13]发现,维生素D3有利于损伤血管内皮细胞，促进血浆脂质及钙对血管壁的侵入和沉积，促使血管钙化，而血管的钙化参与AS的产生和发展过程，从而加速AS形成。基于此种思路，周红等[14]以大鼠为实验对象，在高脂饲料喂养的基础上，设计了3种维生素D3的不同给药剂量，在不同的时间给予腹腔注射，诱导出的动物血脂水平都有增高，但诱导产生的血管病变不尽相同，以中剂量组建立了的模型较理想。

1.2.4 机械损伤法 现有文献已报道了球囊法、辐射损伤法、空气干燥法、下丘脑弓状核损伤法、颈动脉内膜切除法等。王春田等[15]采用高脂饮食联合球囊损伤动脉内膜的方法诱导大鼠腹主动脉粥样硬化动物模型,结果证明该法具有可靠性强，可重复性高，更符合临床动脉粥样硬化疾病的发生发展过程等优点。Cottin等[16]对兔经血管内192Irg辐射，并饲喂2%的高胆固醇饲料。2周时被辐射的动脉有局灶性的巨噬细胞内皮下黏附及内皮的损伤，6周时可观察到血管内AS斑块明显增加。

1.2.5 免疫损伤法 AS的发病机制有免疫因素的存在，所以可以从免疫学的角度来探讨AS模型，如使用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、肺炎衣原体、EB病毒、巨细胞病毒、幽门螺杆菌、内毒素等进行免疫刺激，从而诱发AS的产生。

连伟光等[2]采用高脂饲料饲喂大鼠，并采用牛血清白蛋白(40 mg·kg-1)和卵清白蛋白(2.5 mg·kg-1)进行免疫损伤，并辅以维生素D3(25万U·kg-1)灌胃，成功建立了HFJ大鼠动脉粥样硬化疾病动物模型，可为动脉粥样硬化研究提供一种新的实验动物品系。刘剑刚等[17]采用高脂饲料结合经兔耳缘静脉注射牛血清白蛋白的方法，导致兔AS斑块形成和血脂水平、炎症因子、血小板聚集及血管活性物质等经典指标的异常(有显著相关性)，具有评价价值。曹佳超等[18]从不同角度报道了Cpn与AS的相关性。

1.2.6 基因改造法 各种基因敲除和转基因小鼠是近年来的研究热点之一。ApoE和LDL-R基因敲除鼠可自发形成动脉粥样硬化斑块，是动脉粥样硬化研究的常用模型。在此基础上应用基因打靶技术建立的白介素-1、C反应蛋白、清道夫受体、IgG Fc、补体C1q及CD44等模型,对研究动脉粥样硬化中炎症和免疫因子的作用机制起了重要作用[19]。近来成功报道的通过在受精卵中表达RNA干扰序列而建立的遗传性基因敲除小鼠模型，技术应用成熟,可操作性强，时间上较基因敲除大为缩短[20]。但是由于基因改造小鼠体积小，临床性检查评估很难，与人类脂类代谢差异较大,尤其是某些在人体表达的脂蛋白代谢基因在小鼠体内却不表达，如CETP等局限性，使得家兔模型在AS研究中价值凸现，如天然LDL受体缺陷的遗传性高脂血症WHHL兔，其表型比LDL受体基因敲除小鼠更接近人类疾病，曾经广泛地用于高脂血症的研究，但也有待进一步改造。继续寻找更符合人类自身特点的AS模型依然是本研究领域的重要课题。

2 对AS模型的评价

动物模型是当代医学研究中不可替代的一种重要工具，但模型只是模拟，而不是原型，它的建立方法的逐步改进，是基于人们对AS发病机制研究认识的不断飞跃。无论哪一种As动物模型的建立，都是从AS的发病机制出发，基于不同的研究目的，采取不同的方法。如根据AS形成的脂质浸润学说，采用高脂饲料喂养法;根据损伤-反应学说，采用机械损伤法;根据炎症学说，采用免疫损伤法等。每种方法都有各自的优点和缺点，如高脂饲养法优点是接近人类饮食习惯，造成的模型较接近人类病变，缺点是没有统一的饲料成分配比比例，可重复性较低，造模周期相对较长，模型成功率不高。机械损伤法建立模型快速并且AS的部位明确，缺点是手术要求极高，术后易感染等，对动物损害较大，造模成功率受到影响。免疫损伤法给我们了一个研究AS模型的新的方向，根据抗原抗体反应原理，来寻找AS的病因，此种方法制造的病变模型形成较快，易于制作，可以为使用疫苗防治AS的发生提供思路。但这只是起步阶段，还有很多技术问题有待攻克，有很漫长的研究之路要走。

自1992年美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除(gene knockout)技术培育成ApoE基因敲除小鼠亦称ApoE基因缺陷小鼠后，ApoE基因敲除小鼠也成为目前AS研究中应用最多的基因工程动物，因为它可以用于系统地研究某个基因或者某几个基因和AS的关系，从基因水平阐释病因病机，确定某一确切基因和发病的相关性，从而为从基因层面治疗疾病提供理论依据，它使人类对于AS的认识登上了一个新台阶，促进了人类对AS的新探索。但是，此动物模型较局限，ApoE对AS作用机制还有待深入研究，另外还有一个很重要的缺陷需要注意，即基因改变以后，可能对动物体内细胞或代谢产生其他可知或不可知的影响，从而可能干扰实验结果以及增加对实验结果分析的难度，而且操作技术要求很高，实验设备要求精良，鉴于目前我国国情，还很难在全国广泛推广使用。

根据多数学者认可的钙超载机制，在高脂饲料喂养的同时，选用大剂量的维生素D3，无论是采取腹腔注射的方法，还是实施灌胃法，均可在较短时间内导致动物血钙明显升高，诱发动脉管壁损伤和硬化，形成明显的斑块，这是一种用维生素D3快速诱导AS模型的方法优点;而其缺点是导致了动物食欲减退，食量有所下降，体质量也继而下降，多器官功能异常，甚至死亡率增加。

单一方法制作的动物模型是绝对不能如实准确代表动脉粥样硬化的发病本质。由于AS是在多种遗传及环境因素参与下发病，是由多个重要功能基因异常、血脂代谢异常及炎症反应和免疫因子等互相联系难以分割的多因素共同作用下的一个缓慢复杂的过程，加上动物本身的生理特点及动物与人的种属差异，导致无论哪种方法，都不能翔实全面地复制出人类AS的病理变化和过程。所以在实际运用中，多以高脂饲养为基础，同时叠加各种损伤因素和致炎、致免疫反应因子的破坏作用，以加速血管内皮损伤，加速AS的形成。也只有采用多种方法联合，以摸索出更接近动脉粥样硬化本质，才能为建立操作简便、可靠、可重复的AS动物模型，提供可借鉴的思路,从而为AS诊断、防治及治疗药物的研发创造更好的基础条件。

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