光纤扫描式激光诱导荧光检测系统

杨晓博，闫卫平，杨　飞，白海明

(1．许昌学院电气信息工程学院，河南许昌　461000；2．大连理工大学电子科学与技术学院，辽宁大连　116024)

0　引言

集成毛细管电泳(Integrated Capillary Electrophoresis，ICE)芯片[1-2]是微流控分析系统(Microfluidic Analysis System)的一个重要组成部分，被测样品经分离后的组分及含量要由检测系统来测定[3]，因此，检测系统的性能将决定整个微流控分析系统的精度、灵敏度、速度及适用范围等。与传统分析仪器相比，微流控分析系统要求检测系统有更高的灵敏度、更快的响应速度和更小的尺寸。

激光诱导荧光(Laser Induced Fluorescence，LIF)检测是集成毛细管电泳芯片检测方法中灵敏度和信噪比较高的一种[4]，但是传统的共聚焦式LIF检测系统体积庞大，不利于毛细管电泳检测仪的进一步微型化，因此，文中构建出一种光纤扫描式毛细管电泳芯片LIF检测系统，系统以光纤代替传统LIF系统中复杂庞大的共聚焦式检测光路，采用雪崩二极管作为荧光检测器件，从而构建起结构相对简单、灵敏度高、功耗小的多通道毛细管电泳芯片检测系统。

1　光纤扫描式激光诱导荧光检测系统结构

光纤扫描式四通道毛细管电泳芯片LIF检测系统结构如图1所示，它主要由机械扫描单元、荧光检测光路、光电转换单元和多通道识别单元四部分组成，各部分工作原理如下。

图1　光纤扫描式毛细管电泳芯片激光诱导荧光检测系统结构示意图

1.1机械扫描单元

与齿轮、转盘相连的电动机以一定的速率做匀速圆周运动，从而使扫描轴在曲柄的带动下在毛细管电泳芯片上方做一定角度的扇形扫描运动，进而固定在扫描轴上的激发光纤和接收光纤也随之在芯片上方做往复的扫描，实现了多通道扫描功能。

1.2荧光信号检测光路

激光器发出的绿色激光束经激发光纤照射至多通道毛细管电泳芯片表面，当光束照至电泳芯片上的微通道时，微通道中的荧光染料在激光的激发下产生荧光信号，该荧光信号通过接收光纤传输至光电转换单元进行处理。

1.3光电转换单元

由于毛细管电泳芯片采用的是玻璃材料，不可避免的在其表面会产生光的反射和折射现象，因此，接收光纤中传播的不仅仅有荧光染料受激发产生的荧光，同时芯片表面部分反射和散射的激发光也会通过接收光纤传输至信号处理单元。反射光及散射光是与被测荧光信号无关的干扰信号，需要在信号处理单元中将其滤除掉以提高系统的信噪比(Signal to Noise Ratio，SNR)。

1.4多通道识别单元

多通道识别单元由光调制板、发光二极管(Light Emitting Diode，LED)、光电接收器及信号处理电路组成。其中，光调制板上白色的透光区域和黑色的遮光区域相间排列，透光区域间的距离与多通道毛细管电泳芯片微分离通道之间的距离具有相同的对应关系。

当LED发出的光束照射至光调制板上的透光区域时，光电接收器检测到光信号，输出高电平；反之，当光束照射至遮光区域时，光电接收器检测不到光信号，输出低电平。这样，当光调制板在扫描轴的带动下在毛细管电泳芯片上方往返扫描时，光电接收器的输出端就得到一个脉冲序列。通道识别脉冲如图2所示，当扫描轴从左向右扫描时，脉冲1和2之间对应的是毛细管电泳芯片最左端的分离通道1，脉冲2和3之间对应分离通道2，依此类推；反之，当扫描轴从右向左扫描时，脉冲5和4之间对应分离通道4，脉冲4和3之间对应分离通道3，依此类推。当扫描轴往复扫描时即实现了多通道识别功能。

图2　毛细管电泳芯片通道识别脉冲序列图

2　控制系统及硬件电路设计

控制系统采用STM32F103微处理器为核心芯片，利用其内置的DMA、ADC、USB和UART控制器等实现数据的采集和上传等功能。系统的总体结构框图如图3所示，由STM32F103微处理器、光电转换单元(包括光电传感器、低噪声放大器、低通滤波器)、电源及外围电路、RS-232接口电路和USB接口电路等组成。

图3　嵌入式控制系统整体结构框图

2．1雪崩二极管偏置电路

设计采用体积小、灵敏度较高的雪崩二极管作为光电转换器件。雪崩二极管与光电倍增管相比具有偏置电压低的优点，与PIN光电二极管相比又具有较大的增益，非常适合微弱电泳荧光信号的测量。

电路采用C30902E型雪崩二极管。它的击穿电压较高，增益对外加偏压变化敏感，因此需采用定制的专用高压模块作为偏置高压源。雪崩二极管高压偏置电路原理图如图4所示，其中Vref为高压模块控制信号输入端，输入电压范围为0 ～ 5 V，Vin为12 V电源输入引脚，HV为高压输出引脚，输出电压范围为0 ～ 400 V.此电路通过改变高精度电位器R1的阻值来调节输出偏置电压。图中C1、C2为电源滤波电容，集成运放LM358为电压跟随器，多圈高精度电位器R1的电压信号通过电压跟随器送至高压模块的控制输入端Vref．

图4　雪崩二极管高压偏置电路原理图

2．2信号放大电路

针对雪崩二极管的特性，电路采用低噪声、高输入阻抗的OPA337放大器作为前置放大器，在A/D转换前对前置放大器信号进行二次放大和二阶滤波。信号放大电路由两级放大电路组成，电路原理图如图5所示。由于雪崩二极管输出信号为电流信号，为实现低噪声、高灵敏度放大，电路采用负反馈电流输入前置放大器[5-6]。其中，电位器RV3、RV4用来调节运算放大器的参考端电压，用于对微弱被测信号进行无失真放大；运算放大器U7A和电阻R52构成负反馈电流输入放大器，用于对雪崩二极管输出的微弱电流信号进行放大；电容C67为相位补偿电容；运算放大器U8A和电阻R53、R55构成反向比例放大电路，用于对第一级放大器的输出信号进行二次放大。

图5　信号放大电路原理图

2．3低通滤波电路

在扫描式毛细管电泳芯片LIF检测系统中，荧光信号的检测是通过对扫描得到的多通道脉冲信号采集来实现的。为了最大程度上抑制噪声信号对数据采集的影响，需要对输出脉冲的信号进行滤波，因此，设计采用的滤波器为二阶压控电压源(Voltage Controlled Voltage Source，VCVS)有源低通滤波器[7]。

由奈奎斯特采样定理可知，在进行模拟/数字信号的转换过程中，当采样频率fs大于信号中最高频率fmax的2倍时，即fs≥2fmax，则采样之后的数字信号便可完整保留原始信号中的信息。由于电路设计中的最低采样频率为7 kHz，因此截止频率小于3．5 kHz的滤波器都可以满足需要。二阶VCVS有源低通滤波器电路原理图如图6所示，其截止频率fc和增益K分别为：

图6　二阶VCVS有源低通滤波器电路原理图

2．4通道识别电路

通道识别单元是扫描式LIF检测系统的一个非常重要的组成部分，它主要由通道计数器复位电路和识别脉冲产生电路组成，其工作原理图如图7所示。图中的运算放大器LM358和电位器RV4构成电压比较器电路，用以对光电转换单元输出的信号进行整形。在系统扫描检测的过程中，当光调制板的透光区与发光二极管、光敏三极管在垂直方向上重合时，二极管发出的光被光敏三极管接收，光电转换后的脉冲信号作为主处理器的外部中断信号，主处理器中的计数器对通道识别脉冲进行计数，最后根据计数值并结合其他因素实现通道识别。

图7　通道识别电路原理图

3　系统软件设计

在光纤扫描式毛细管电泳芯片LIF检测系统的实现过程中，系统控制、数据的采集传输、波形绘制、检测结果的显示都是通过软件实现的。由于实时操作系统不仅能提供灵活的编程接口和丰富的任务管理及任务间通信机制，同时又能简化嵌入式软件的开发过程、缩短调试周期，此外，实时操作系统本身所占内存资源较少、CPU占用率低、便于以后对功能进行扩展，因此设计采用嵌入式操作系统μ COS-II作为软件开发的支持平台，结合STM32 Firmware函数库及μCOS内核实现设备控制及数据采集功能。在PC端采用Visual C++为开发环境，使用Win32 API操纵PC机的串口实现数据的采集，借助于Microsoft Foundation Class的强大图形绘制及显示功能实现数据波形的绘制及检测结果的显示。

4　测试结果及分析

4．1毛细管电泳芯片结构

光纤扫描式LIF系统中使用的四通道毛细管电泳芯片结构如图8所示。其中1、2、3、4分别为样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲废液池；进样通道长10 mm，分离通道长40 mm，检测点与十字交叉点处的距离为30 mm；通道深60 μm，宽100 μm，储液池直径为2 mm，容积约为5 μL；整个芯片尺寸为60 mm × 50 mm．

图8　四通道毛细管电泳芯片结构示意图

4．2电泳分离实验操作

毛细管电泳分离实验的步骤为：配置缓冲液和罗丹明B样品溶液；清洗芯片通道，然后置于恒温箱中烘干；将缓冲液注入电泳通道，用光学显微镜观察通道中有无气泡和微小颗粒，确定没有后准备进入下一阶段；设置进样电压和分离电压(进样电压：样品池600 V，样品废液池0 V，缓冲液池400 V，缓冲废液池600 V；分离电压：缓冲液池800 V，样品池、样品废液池均为600 V，缓冲废液池0 V)；芯片置于检测平台之上，调整扫描探头与芯片间的垂直和水平方向上的距离，以达到最佳检测位置；将样品溶液注入样品池，插入电极；起动高压电源和检测系统的扫描检测，绘制检测结果；待检测曲线绘制完毕后，如果二次进样则重复上述过程，否则关闭系统；取出芯片后用无水乙醇进行清洗；待实验结束后检查系统。

4．3样品的进样和分离

此时，四通道毛细管电泳芯片的第1、2通道注入纯净水，第3、4通道分别注入1．0 × 10-5M、1．0 × 10-4M

的罗丹明B样品溶液并施加分离电压。检测系统对四通道扫描得到的电泳谱图如图9所示。由于第1、2通道中注入的为纯净水，它们的检测信号幅值为零，其检测曲线相互交叠，并与横轴相重叠。另外的两条曲线则反映了毛细管电泳分离的过程：开始进样时，样品还没有进入分离通道，放置在检测部位的光电探测器没有检测到激光激发出的荧光信号，故曲线前一部分值为零；当样品被切换到分离通道，并在分离电压的作用下移动到光电探测器检测部位时，激光激发出的荧光信号立即被光电探测器接收，对应的检测曲线出现峰值；当样品全部通过检测点后，没有荧光信号，检测曲线值重新降为零。此外，由于通道4中样品的浓度较大，因此，其对应的电泳谱图峰值也较大。

图9　四通道毛细管电泳芯片不同浓度样品时的电泳分离谱图

5　结束语

文中主要围绕LIF检测原理，利用光纤搭建激发及检测光路，设计出扫描式多通道毛细管电泳芯片检测系统。系统采用曲轴完成了电机的匀速旋转到扫描轴的扫描这一转变，实现了对多通道毛细管电泳芯片的扫描式检测。系统对不同浓度的罗丹明B样品溶液进行了电泳分离实验，检测结果表明搭建的光纤扫描式LIF检测系统可以实现对多通道毛细管电泳芯片的实时并行检测。

参考文献：

[1]王立鼎，刘军山，于建群．集成毛细管电泳芯片研究进展．大连理工大学学报，2003(4)：385-392．

[2]DOLNIK V，LIU S，JOVANOVICH S．Capillary electrophoresis on microchip．Electrophoresis，2000，21(1)：41-54．

[3]UCHIYAMA K，NAKAJIMA H，HOBO T．Detection method for microchip separations．Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，379(3)：375-382．

[4]邬丽明，时宝宪，黄卫华，等．芯片毛细管电泳荧光检测器灵敏度的研究．分析科学学报，2007(2)：160-162．

[5]远坂俊昭．测量电子电路设计——模拟篇．北京：科学出版社，2006．

[6]谭博学．集成电路原理及应用．北京：电子工业出版社，2008．

[7]彭军．运算放大器及其应用．北京：科学出版社，2008．