硬枝碱蓬HPLC指纹图谱建立及模式识别研究

马 涛 赵 宇 韩占江

(塔里木大学植物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

盐渍土壤是制约农业生产的重要因素之一，新疆有盐渍土约为0.13亿hm2，是我国盐渍土分布最广、面积最大的省区[1，2]。新疆的耕地近1/3盐渍化，开发利用耐盐植物是新疆植物研究的重点之一，是合理利用盐渍土壤的重要方法。盐生植物是一个宝贵的天然耐盐基因库，尤其是具有经济价值的材料，可以利用它们自身的耐盐性直接引种驯化、开发应用，也可以通过基因工程手段把耐盐基因整合到非盐生植物中，使其成为耐盐的转基因植物。

硬枝碱蓬(SuaedarigidaH. W. Kung et G. L. Chu)是孔宪武1978年发表的一个植物新种[3]，是藜科碱蓬属中最高大的一种强木质化草本[4]，是塔里木盆地的特有植物，真盐生植物，其植株高大，枝叶繁茂，是一种营养丰富的野生蔬菜，又是当地优良的牧草资源，具有重要的经济价值和生态价值[5，6]。前人对硬枝碱蓬的地理分布、群落特征、生境土壤状况、叶片解剖特征及种子形态等进行了一系列研究，发现硬枝碱蓬是很好的耐盐材料[7，8]。笔者前期调查发现，硬枝碱蓬主要分布在塔克拉玛干沙漠北缘，大致沿库尔勒-阿克苏-巴楚-喀什一线分布。

中药指纹图谱(fingerprinting)是借用DNA指纹图谱发展而来，应用较早较多的是中药化学成分色谱指纹图谱，特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。建立中药指纹图谱的目的是全面反映所含化学成分的种类与数量，进而评价样品的质量[9，10]。中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典A版)(以下简称为中药相似度软件)可对色谱图进行对照处理，快速检测样品物质与含量的相似性。不同生境下，同一植物的生长特性变现可能存在差异，因此，本文采用高效液相色谱法建立硬枝碱蓬的指纹图谱，采用中药相似度软件对该试验的准确度、精密度进行检测，并对不同产地的硬枝碱蓬进行主成分分析(Principal components analysis，PCA)，为后续研究所用材料的均一性提供保证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

新鲜采摘的硬枝碱蓬(采自塔里木大学东北角虹桥路旁，阿拉尔5团，阿拉尔12团，阿拉尔16团，沙雅，库车，和静，巴楚，阿拉尔至沙雅公路旁9个地点)。

1.1.2 试验试剂

甲醇、乙腈为分析纯(天津博迪化工股份有限公司)，无水甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司)。

1.1.3 试验仪器

所用仪器主要有Prominence LC20A岛津液相色谱仪，KQ-100VDE双频数控超声波清洗器，Typc HP-01无油真空泵，FZ102粉碎机等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的前处理

将新鲜采摘的硬枝碱蓬去除泥土和杂草，选取完整的植株洗净，通风无光条件下放置7-10 d，使其充分干燥。选取植株的茎叶部分，放入粉碎机中充分粉碎，过80目筛制得样品粉末。

1.2.2 提取溶剂的选择

称取6份2. 000 g样品粉末放入50 mL容量瓶中，分别加入25%乙腈、50%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇作为提取剂震荡摇匀，过滤，超声提取40 min，抽滤，滤液经0.45 μm有机滤膜过滤，制得待测样液，于4 ℃冰箱内保存，备用。

1.2.3 提取溶剂用量的选择

称取5份2. 000 g样品粉末放入50 mL容量瓶中，分别加入100%甲醇50 mL、30 mL、20 mL、15 mL、10 mL，震荡摇匀，过滤，超声提取40 min，抽滤，滤液经0. 45 μm有机滤膜过滤，制得待测样液，于-4℃冰箱内保存，备用。

1.2.4 色谱条件的优化

流动相：乙腈(A)-水(B)或甲醇(A)-水(B)，采用100%乙腈或100%甲醇等度洗脱；流速：1. 0 mL/min；进样体积：10 μL；色谱柱：inertsil ODS-SP 4. 6 mm×250 mm×5 μm；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：由于仪器在进样时是自动全波长(190 nm-800 nm)检测，所以进样后选择200 nm、210 nm、220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、260 nm、270 nm、280 nm、290 nm、300 nm处样品色谱图，选择出峰多、峰形好的波段，进一步比较分析，选择出最佳检测波长。

1.2.5 精密度试验

使用同一产地的硬枝碱蓬制备5个样品溶液，每个样品连续进样5次，使用中药相似度软件进行对比，获得图谱之间的相似度，确定此次试验使用方法的精密程度。

1.2.6 重现性试验

使用同一产地的硬枝碱蓬，制备5个样品溶液，对其进样分析，使用中药相似度软件进行对比，获得图谱之间的相似度，确定此次试验的重现性能。

1.2.7 稳定性试验

制备一个样品溶液，在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d进样测定，使用中药相似度软件进行对比，获得图谱之间的相似度，确定样品溶液的稳定性。

1.2.8 生成对照图谱

将不同产地的硬枝碱蓬制备成样品溶液P1～P9，每一份样品溶液做两次平行试验，选取最优色谱图，得出P1～P9样品的指纹图谱。使用中药相似度软件对P1～P9样品的指纹图谱进行比较分析，生成对照图谱，作为硬枝碱蓬的标准指纹图谱。

1.2.9 主成分分析

本次试验使用主成分分析法(PCA)来进行模式识别研究，即将这些样品中的所有峰的保留时间进行组合，进行散点作图，达到“物以类聚”的效果，很直观的反映出各个样本之间的关系，实现模式识别的目的。

2 结果与分析

2.1 样品处理及色谱条件的确定

如图1所示，S1～S6分别为25%乙腈、50%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇做提取溶剂的HPLC指纹图谱，经对比确定使用100%甲醇作为样品的提取溶剂处理效果较好，如图1中S6。经测定，使用15 mL100%甲醇做为提取溶剂时，样品溶液浓度适合，出峰较多，峰形较好。流速为1.0 mL/min时，色谱图中各峰分离效果明显，检测波长选择254 nm处，色谱图峰形较好，进样时间选择20 min，流动相为甲醇(A)-水(B)，采用100%甲醇等度洗脱。

表1 样品1精密度试验相似度

表2 样品2精密度试验相似度

表3 样品3精密度试验相似度

表4 样品4精密度试验相似度

表5 样品5精密度试验相似度

图1 不同提取溶剂的HPLC指纹图谱

2.2 精密度试验结果

对五个样品溶液连续重复进样5次后，经相似度分析，获得各图谱之间的相似度均在0. 99以上，表明该试验方法精密度好。如表1～5。

2.3 重现性试验结果

进样同一个产地样品制备的5个样品溶液，经相似度分析，获得图谱之间的相似度在0. 97以上，表明此次试验重现性良好。如表6。

表6 重现性试验相似度

2.4 稳定性试验结果

同一个样品溶液，在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d后进样测定，经相似度分析，获得图谱之间的相似度均在0. 99以上，表明所制得的试剂在9 d时间内是稳定的。如表7。

表7 稳定性试验相似度

2.5 对照图谱

重新配制9个不同产地的样品溶液进样测定，每个样品做两次平行测定，选取最优色谱图作为样品模版，使用中药相似度软件对9个色谱图进行处理，生成样品的对照图谱，这个对照图谱便可作为硬枝碱蓬的指纹图谱。如图2，R为生成的对照图谱。

图2 硬枝碱蓬对照图谱

运用中药相似度软件，对P1～P9进行相似度评价。如表8。9个样品的相似度均大于0. 9，说明这9个样品属于同一种物质。

表8 硬枝碱蓬相似度评价

2.6 主成分分析

使用simca-p 11.5软件对P1～P9样品的色谱图数据进行拟合模型处理并识别特异点，获得9个样品主成分的散点图。如图3所示，P1、P6和P8相似，P4和P5较为相似，其余样本均有不同，由此可以看出不同产地的硬枝碱蓬有一定的差异性。

图3 PCA散点图

3 结论

3.1 选取检测方法

此次试验选用HPLC法测定样品指纹图谱，与经典液相色谱法相比，具有分离效率高、分析速度快、定量精密度高、检测器种类多、灵敏度高、稳定性和重现性好等特点。

3.2 色谱条件的优化

试验确定的最佳条件为用100%甲醇作为样品的提取溶剂，用量为15 mL，流速为1. 0 mL/min，色谱进样时间为20 min，流动相为甲醇(A)-水(B)，采用100%甲醇等度洗脱，检测波长为254 nm。

3.3 模式识别

在PCA分析中，相同地区的样品被归为一类，有差异的样品会明显地与其他样品区分开来，可以直观的反映各个样本之间的聚类关系。通过PCA分析，得到的样品的归类与实际情况相符，说明基于PCA的模式识别方法有效、可靠，为硬枝碱蓬的质量控制和综合评价奠定了基础。

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