Sox10和EDNRB在人胚胎肠神经系统发育中的表达

李颖，黄英，王大佳，王维林

（中国医科大学盛京医院小儿外科，沈阳110004）

Sox10和EDNRB在人胚胎肠神经系统发育中的表达

李颖，黄英，王大佳，王维林

（中国医科大学盛京医院小儿外科，沈阳110004）

目的动物实验和先天性巨结肠患儿狭窄段肠管的相关实验已经证实EDNRB与Sox10在肠神经系统发育中发挥重要作用，而对人胚胎肠神经发育的研究较少，我们通过检测Sox10、EDNRB在人胚胎后肠的表达情况，探讨二者与肠神经系统发育的关系，从而为进一步探讨先天性巨结肠病因提供基础性研究。方法应用免疫组化SP方法检测32例7～12周人胚胎后肠Sox10、EDNRB的表达情况，并以神经营养因子p75NTR标记肠神经嵴细胞。结果Sox10：7～8周，仅在浆膜层有很弱的阳性表达；9～10周，阳性表达明显增强，表达于肠道外缘的浆膜层和环肌层，黏膜下的肠道间质中也有少许表达。11～12周，表达较前稍减弱。EDNRB：7～8周，浆膜层有很弱的阳性表达；9～10周，阳性表达明显增强，表达于肠道环肌层和浆膜层，黏膜下也有少许表达；11～12周表达模式与9～10周相似，仍表达于肠道环肌层和浆膜层。同一标本，经连续切片，免疫组化染色显示p75NTR标记的神经嵴细胞阳性表达几乎与Sox10、EDNRB表达成一致性。结论Sox10、EDNRB的阳性表达说明二者参与了人胚胎后肠肠神经系统的发育过程。

肠神经系统；先天性巨结肠；EDNRB；Sox10；人胚胎

先天性巨结肠（Hirschsprung′s disease，HD）又称肠管无神经节细胞症（aganglionosis），是一种常见的肠道神经发育畸形，发病率为1/5 000。它是由于肠壁黏膜下层神经丛和肌间神经丛中神经节细胞缺失导致的先天性肠道运动障碍性疾病，肠神经系统发育与神经嵴细胞迁移、分化、定位密切相关，因此认为HD是一种神经嵴疾病。已有的研究表明，Sox10［1］和EDNRB［2，3］在肠神经发育过程中起着至关重要的作用，而目前关于肠神经发育时期的研究较多为禽类和鼠类，而对人肠神经发育的研究较少。我们研究了人胚胎7～12周肠神经系统发育这一重要时期中Sox10、EDNRB的时空表达情况，并以神经营养因子受体（p75NTR）标记神经嵴细胞（neural crest cell，NCC），从而进一步探讨Sox10、EDNRB在人类肠神经系统发育的作用，为研究HD病因提供基础性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

32例人类胚胎标本（来源于中国医科大学盛京医院节育门诊，并获得医院伦理委员会认可［2012 PS80K］）根据Carnegie分期及月经龄及彩超提示，分为3组：7～8周（10例）；9～10周（13例）；11～12周（9例）。

1.2 方法

将整个胚胎放入4%多聚甲醛溶液，4℃固定24 h，取其后肠，常规石蜡包埋组织切片备用，片厚4 μm；免疫组化染色，一抗试剂Sox 10（武汉博士德生物公司），EDNRB（北京博奥森生物公司），p75NTR（北京博奥森生物公司），浓度为1∶160，4℃过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色。经苏木素复染，脱水、透明后封片。PBS代替一抗作为阴性对照，全部切片由两位有经验的病理医师观察并诊断。胞质中出现棕黄色颗粒者为阳性，观察Sox 10、EDNRB，p75NTR抗体表达情况。采用图像采集软件（NIS-ElementsF3.0）对所有标本数码照片（200×，400×）图像进行采集。（SP试剂盒及DAB显色剂购自北京中杉金桥有限公司）。

2 结果

2.1 Sox10在7～12周人胚胎后肠中的表达

在应用SP法检测Sox10蛋白的表达分析，发现Sox10的阳性表达为棕黄色颗粒。7～8周（10例），仅在浆膜层有很弱的阳性表达；9～10周（13例），阳性表达明显增强，表达于肠道外缘的浆膜层和环肌层，黏膜下的肠道间质中也有少许表达；11～12周（9例），表达较前稍减弱（图1）。

图1 Sox10在7～12周人胚胎后肠中的阳性表达及阴性对照SP×400Fig.1 Expression of Sox10 at 7⁃12week in human hindgut SP×400

2.2 EDNRB在7～12周人胚胎结直肠中的表达

应用SP法检测EDNRB蛋白的表达分析，发现EDNRB的阳性表达为棕黄色颗粒。7～8周10例），浆膜层有很弱的阳性表达；9～10周（13例），阳性表达明显增强，表达于肠道环肌层和浆膜层，黏膜下也有少许表达；11～12周（9例），表达模式与9～10周相似，仍表达于肠道环肌层和浆膜层（图2）。

2.3 p75NTR标记的神经嵴细胞阳性表达与Sox10、EDNRB表达成一致性

同一标本，经连续切片，免疫组化染色显示p75NTR标记的神经嵴细胞阳性表达几乎与Sox10、EDNRB表达成一致性（图3）。

3 讨论

肠神经系统是由起源于NCC的神经元和神经胶质细胞聚集而成，在胃肠道内形成相对独立的神经网络。通过研究证实［4，5］，肠神经元主要来源于迷走神经嵴，并按首尾方向迁移、扩增和分化形成黏膜下神经丛和肌间神经丛。一小部分来源于骶神经嵴［6］，Katsumi等［7］发现骶神经嵴是由尾部向头侧迁移，迁移时间要晚于迷走神经嵴。

在鼠类胚胎中，迷走神经嵴细胞在胚胎的E9～E9.5迁移至前肠，E13.5～14迁移到整个肠道，骶神经嵴细胞通常在E12～E16。这一延迟的表现可能说明骶神经嵴的迁移需要迷走神经嵴源性的细胞在迁移过程中释放某种因子或者需要某种信号通路［8，9］。人胚胎期神经嵴的迁移方式与禽、鼠类相似，按照首尾模式，第4周迁移至胃，第7周时迁移至后肠［10］，并且人胚胎期后肠肠神经系统发育有一定的时间顺序，肠神经系统和肠管壁的发育是同步进行的。p75NTR是肿瘤坏死因子受体超家族中的成员，为一跨膜糖蛋白，是神经营养素的低亲和力受体，作为神经元生长存活与凋亡的重要调节因子，在神经系统中广泛分布。本实验中，7～8周时，肠道各层发育不明显，以p75NTR作为神经标志物的免疫反应中仅在肠道浆膜层出现很弱的阳性表达。9～10周时，肠道环形肌发育明显，原始肌间神经丛位置处p75NTR阳性信号也同时增强。而11～12周时，肠壁进一步分化，肌间隙增宽，阳性表达大致与9～10周相同。

图2 EDNRB在7⁃12周胚胎后肠中的阳性表达及阴性对照SP×400Fig.2 Expression of EDNRB at 7⁃12w in human hindgut SP×400

图3 p75NTR与Sox10、EDNRB阳性表达几乎一致及阴性对照SP×400Fig.3 Co⁃localization of p75NTRstaining in Sox10 and EDNRB positive cells SP×400

Sox10是SRY（sex determination region on the Y chromosome）相关家族成员之一，位于人染色体22q13，主要特征是含有一个保守的HMG-box DNA结合域，参与胚胎发育和细胞命运决定的调控。Sox10基因突变可能会引起编码蛋白质DNA结合区域发生改变，以致不能与相应的DNA结合而引起其调控的下游基因不能正常转录，从而导致表达的缺失。Dom鼠模型对于研究人类HD合并色素缺失和/或先天性耳聋以及ENS发育中基因突变和突变后造成的各种缺陷有了进一步的了解。Dom鼠模型是Sox10基因突变导致这种小鼠系出现以肠神经节细胞缺乏和表皮白斑为特征的HD表型。Sox10 Dom鼠杂合型自发突变和靶突变会导致常见型无神经节细胞症，而纯合型突变会导致全结肠型无神经节细胞症和其他严重的神经嵴性缺陷。在小鼠胚胎中，Sox10在神经嵴细胞迁移过程中表达，并在交配后12.5 d的肠道肌间神经节中检测到。Sham等［11］研究结果显示HD患儿神经节缺失的肠管中Sox10阳性表达显著降低，并且进一步研究提示Sox10不仅在ENS的早期发育中起重要作用，而且对于胚胎发育晚期维持神经元和胶质细胞正常功能也是必需的。

EDNRB属于G蛋白耦联受体超家族，与其配体内皮素-3（EDN-3）有高亲和力结合。EDNRB/EDN-3信号通路在肠神经节细胞的正常发育中起重要作用。EDNRB是迷走神经嵴和躯干神经嵴正常发育所必需的［12］，EDNRB基因敲除或自发突变的小鼠表现为远端结肠神经嵴源性的神经元缺失（HD），表皮和躯干色素缺乏［13］。在人类，EDNRB基因突变只在散发的HD患者中检测到，尽管EDNRB基因突变率很低，但是突变常会导致短段型HD的发生［8］。

先前有实验证实，Sox10阳性信号最早出现在人胚胎期第4周神经嵴细胞还未开始迁移的时候，特别是在背根神经节处［14］，并且在迁移过程中和后期神经元的成熟都起着至关重要的作用。但是EDN-3/EDNRB信号通路与ENS发育和先天性巨结肠的致病因素都密切相关，EDNRB表达于胚鼠神经嵴细胞迁移的E10.5～E12.5，EDN-3、EDNRB表达于胎儿期肠道的神经元与肠道间质中，显示其二者可能参与神经嵴细胞与肠道间质细胞间的相互作用，并维持正常神经嵴细胞的迁移过程［15］。对于EDNRB在人肠神经系统发育的研究甚少。我们观察到，7～8周时Sox10、EDNRB的仅在肠道浆膜层有很弱的阳性表达，9～12周阳性表达明显增强，在肠道的浆膜、环肌层及黏膜下层中有表达，p75NTR标记的神经嵴细胞阳性表达几乎与Sox10、EDNRB成一致性，提示Sox10、EDNRB参与了人胚胎后肠神经系统的发育。

我们研究的结果显示Sox10、EDNRB在ENS发育过程中有表达，推测二者可能在ENS正常发育中起一定作用，但是Sox10、EDNRB的作用机制以及与其他基因的相互作用仍需进一步研究。随着分子生物学实验技术的发展，使得人们能从分子、基因水平来解释ENS相关的肠道疾病。然而对于HD这样一种多致病因素的疾病，还需要我们更进一步的研究。

［1］Shin MK，Levorse JM，Inqram RS，et al.The temporal requirement for endothelin receptor-B signalling during neural crest development［J］.Nature，1999，402（6761）：496-501.

［2］Sidebotham EL，Woodward MN，Kenny SE，et al.Localization and endothelin-3 dependence of stem cells of the enteric nervous system in the embryonic colon［J］.J Pediatr Surg，2002，37（2）：145-150.

［3］Betters E，Liu Y.A analysis of early human neural crest development［J］.Dev Bio，2010，344（2）：578-592.

［4］Yntema CL，Hammond WS.The origin of intrinsic ganglia of trunk viscera from vagal neural crest in the chick embryo［J］.J Comp Neurol，1954，101（2）：515-541.

［5］Le Douarin NM，Teillet MA.The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo［J］.J Embyol Exp Morphol，1973，30（1）：31-48.

［6］Burns AJ，Le Douarin NM.The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut：spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system［J］.Development，1998，125（21）：4335-4347.

［7］Miyahara K，Kato Y，Kago H，et al.Visualization of enteric neural crest cell migration in SOX10 transgenic mouse gut using timelapse fluorescence imaging［J］.Pediatr Surg，2011，46（12）：2305-2308.

［8］Barlow A，de Graaff E，PachnisV，et al.Enteric nervous system progenitors are coordinately controlled by the G protein-coupled receptor EDNRB and the receptor tyrosine kinase RET［J］.Neuron，2003，40（5）：905-916.

［9］Young，HM，Hearn CJ，Ciampoli D，et al.A single rostrocaudal colonization of the rodent intestine by enteric neuron precursors is revealed by the expression of Phox2b，Ret，and p75 and by explants grown under the kidney capsule or in organ culture［J］.Dev Biol，1998，202（1）：67-84.

［10］Fu M，Lui VH，Sham MH，et al.HOXB5 expression is spatially and temporarily regulated in human embryonic gut during neural crest cell colonization and differentiation of enteric neuroblasts［J］.Dev Dyn，2003，228（1）：1-10.

［11］Sham MH，Lui CH，Fu M，et al.SOX10 is abnormally expressed in aganglionic bowel of Hirschsprung′s disease infants［J］.Gut，2001，49（2）：220-226.

［12］Heanue TA，Pachnis V.Enteric nervous system development and Hirschsprung′s disease：advances in genetic and stem cell studies［J］.Nat Rev Neurosci，2007，8（6）：466-479.

［13］Hosoda K，Hammer RE，James A，et al.Targeted and natural（piebald-lethal）mutations of endothelin-B receptor gene produce megacolon associated with spotted coat color in mice［J］.Cell，1994，79（7）：1267-1276.

［14］Betters E，Liu Y，Kjaeldgaard A，et al.Analysis of early human neural crest development［J］.Dev Biol，2010，344（1）：578-592.

［15］Shin MK，Levorse JM，Ingram RS，et al.The temporal requirement for endothelin receptor-B signalling during neural crest development［J］.Nature，1999，402（6761）：496-501.

（编辑裘孝琦）

Sox10 and EDNRBExpression during Enteric Nervous System Developmentin Human Embryos

LIYing，HUANGYing，WANGDa-jia，WANGWei-lin
（DepartmentofPediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medicine University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo determine the spatiotemporal expression of Sox10 and EDNRB during hindgut development in human embryos，and explore their clinical significance since they play important roles in the development of Hirschsprung's disease.MethodsThe embryos（n=32）were sectioned serially and sagittally，and immunohistochemically stained with Sox10 and EDNRB antibodies on the hindgutfrom 7th-12th weeks ofgestation，and the neural crest cells were labeled using antibody of neurotrophin receptor p75NTR.ResultsIn the samples of 7-8th week，only few Sox10，EDNRB positive staining were observed in the hindgut serosa layer；while in the 9-10th week，Sox10 and EDNRB positive signals were remarkably increased in tunica submucosa，circularmuscles and serosa layers；a similardistribute pattern wasfound in 11-12th week as 9-10th week；Using the same specimen and serial section，we found that the positive signals largely overlapped with p75NTR positive cells.ConclusionThe expression ofSox10 and EDNRBwere confirmed in human hindgut，indicating thatSox10 and EDNRB mightplay roles in ENS formation in the gut.

enteric nervous system；Hirschsprung′s disease；Sox10；EDNRB；human embryo

R726

A

0258-4646（2014）03-0243-04

辽宁省教育厅高校科研计划（L2010608）

李颖（1987-），女，住院医师，硕士.

黄英，E-mail：huangy@sj-hospital.org

2013-11-21

网络出版时间：