肺炎支原体感染对BALB/c小鼠肺组织半胱氨酰白三烯及其受体表达的影响

焦绪勇，张晗，尚云晓，何梦博，王莉，王桂珍

（中国医科大学1.附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳110004；2.基础医学院病原微生物学教研室，沈阳110001）

肺炎支原体感染对BALB/c小鼠肺组织半胱氨酰白三烯及其受体表达的影响

焦绪勇1，张晗1，尚云晓1，何梦博2，王莉1，王桂珍2

（中国医科大学1.附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳110004；2.基础医学院病原微生物学教研室，沈阳110001）

目的探讨肺炎支原体（MP）感染对BALB/c小鼠肺组织半胱氨酰白三烯（CysLTs）及其受体（CysLTs-R）表达的影响。方法100只BALB/c小鼠随机分成肺炎支原体感染组（MP组）和PBS对照组（N组），每组50只，分别于接种后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d从各组中取5只小鼠，取其肺组织，收集肺泡灌流液（BALF），用ELISA试剂盒检测CysLTs的含量；同时将肺脏固定于中性甲醛中，制作病理切片，HE染色观察病理组织学变化；免疫组织化学技术检测CysLTs-R的表达情况；用Western blot实验检测肺组织中CysLTs-R的表达变化。结果病理组织学观察结果显示，MP感染BALB/c小鼠3 d后，即出现间质性炎症改变，7 d后炎症明显，14 d后炎症逐渐减轻并于30 d时基本消退；ELISA检测结果表明，与N组比较，MP组BALF中CysLTs含量明显增高（P＜0.05），于感染后7 d和14 d达到高峰，而后呈下降趋势；免疫组化结果显示，在MP感染后，CysLTs-R蛋白在气管上皮细胞表面的表达增强；Western blot结果显示MP组小鼠于感染后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d，肺组织中CysLTs-R蛋白的表达量均高于N组。结论MP感染可以显著增加正常BALB/c小鼠中CysLTs及CysLTs-R的表达水平。

肺炎支原体；半胱氨酰白三烯；半胱氨酰白三烯受体；BALB/c小鼠

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）感染引起的原发性非典型肺炎，其主要感染儿童和青少年［1］。MP感染可以促进细胞因子、炎性介质及生长因子等的释放，从而介导气道炎症和免疫反应［2］。随着人们对气道炎症研究的深入，白三烯（leukotriene，LT）及其受体在气道炎症和免疫反应中的作用越来越得到重视［3］。研究显示，LT在体内含量虽微，但是却有很高的生理活性，并且是某些变态反应、炎症以及循环、呼吸系统等疾病中重要的化学介质，其中半胱氨酰类白三烯（CysLTs）具有很强到收缩作用，可激活大部分白细胞，促进白细胞脱颗粒，中性粒细胞渗出，并能够促使白细胞黏附于血管内皮和血浆外渗，从而参与气道炎症的发病过程［4］。新近研究表明，婴幼儿喘息性疾病的血、尿中LT浓度呈持续增高的状态［5］。而在MP感染中LT及其受体的变化以及LT是否介导其炎性反应的报道较少。本实验旨在探讨MP感染对小鼠肺组织中CysLTs含量及CysLTs-R表达的影响，为MP感染机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组：100只SPF级BALB/c小鼠，4～6周龄，体质量14～16 g，雌雄各半，由中国医科大学实验动物中心提供。随机分成MP感染组（MP组）和PBS对照组（N组），每组50只。

1.1.2 主要试剂与仪器：MP国际标准株由中国医科大学病原微生物教研室提供；CysLTs ELISA试剂盒购自美国R&D公司；兔抗小鼠CysLTs受体抗体和羊抗兔多克隆二抗为Abcam公司产品；免疫组化染色试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 肺炎支原体的接种：MP组50只BALB/c小鼠，用10%水合氯醛（0.05 mL/只）腹腔注射麻醉，参考文献［2］方法，每只小鼠滴鼻接种浓度为1×108CCU/mL MP菌液20 μL，将小鼠的头后仰30～45°，随小鼠的自然呼吸动作，MP菌液到达下呼吸道。N组50只小鼠以等量的PBS代替MP菌液给小鼠滴鼻接种。

1.2.2 标本采集与保存：分别于接种后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d从各组中取5只鼠，10%水合氯醛麻醉，心尖取血，分离血清，-80℃保存。分离颈部气管，结扎右主支气管，气管插管约0.2 cm，分3次从气管插管处缓慢注入4℃预冷的PBS溶液进行支气管灌洗，每次0.5 mL，保留30 s缓慢回抽，收集全部支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），4℃2 000 r/min离心10 min，取上清-80℃冰箱冻存。完整分离心肺组织，结扎右肺支气管，迅速取下右中肺，置于中性甲醛中，其他右肺组织放入EP管中-80℃冻存。

1.2.3 检测指标：应用ELISA检测试剂盒对采集的BALF中CysLTs含量进行检测，具体步骤按说明书进行，显色后用酶标仪进行检测，绘制标准曲线，计算CysLTs相对含量。取固定于甲醛的组织，制作病理切片，一部分进行HE染色观察其病理组织学变化，另一部分用免疫组织组化方法检测肺组织中CysLTs-R蛋白的表达情况。进一步用Western blot法检测肺组织中CysLTs-R蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析

各组实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料均以表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐时采用LSD检验；方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化（图1）

图1 各实验组BALB/c小鼠肺脏病理组织学结果×400Fig.1 The lung histopathological results of BALB/c mice in each group×400

N组肺泡结构较为均匀与清晰，肺泡内无渗出，偶见淋巴细胞和巨噬细胞浸润在支气管和血管周围及肺泡中（图1A）；MP感染BALB/c小鼠3 d后，肺泡内有渗出物，肺泡间质增宽，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润（图1B）；MP感染BALB/c小鼠7 d后，肺泡间质明显增宽，在支气管和血管周围及肺泡间质中有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润（图1C）；MP感染小鼠14 d后，肺泡间质稍有增宽，淋巴细胞和巨噬细胞浸润减少（图1D）；MP感染小鼠21 d后，可见肺泡间质稍有增宽，有少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润（图1E）；MP感染BALB/c小鼠30 d后，在支气管、血管周围可见少量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润（图1F）。

2.2 肺组织中CysLTs-R蛋白的表达

免疫组织化学检测结果如图2A所示，各组均见有棕黄色颗粒表达，主要表达集中在各级支气管（细支气管、终末细支气管和呼吸性细支气管）的气道上皮细胞。进一步用图像分析软件（NIS-Elements Br 3.0）对CysLTs受体阳性部位进行原位定量检测，得到光密度（OD）值，结果如图2G所示，同N组比较，MP组各时间点CysLTs-R表达信号均显著增加（P＜0.05），于MP感染后第14天阳性信号最强，而后于21 d起逐渐减弱。

2.3 CysLTs含量的检测

图2 CysLTs⁃R蛋白在各组小鼠支气管和肺组织的表达Fig.2 The expression of CysLTs⁃R protein in bronchus and lung tissues in mice of each group

用ELISA试剂盒对各实验组BALF中的CysLTs含量进行检测，结果如图3所示。与对照组比较，MP组于各时点CysLTs含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。组内比较显示，MP组中CysLTs含量从感染后第3天起即上升，于感染后第14天达到高峰，但2者差异不具有统计学意义（P＞0.05），21 d后逐渐下降，与第14天比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组小鼠BALF中CysLTs含量的变化Fig.3 The content changes of CysLTs in BALF of mice from each group

2.4 CysLTs-R蛋白表达分析

用Western blot对肺组织中CysLTs-R蛋白表达水平进行检测，结果如图4所示，在感染MP后，第3天、第7天、第14天、第21天、第30天CysLTs-R蛋白均较正常对照组表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体引起以间质病变为主的急性肺部感染，其发病率逐年递增，流行病学调查显示，在美国，30%社区获得性肺炎患者系MP所致［6］。我国MP感染所致肺炎占小儿肺炎的10%～20%。MP已成为小儿下呼吸道感染的重要病原，其发病无季节性，在封闭人群中，MP可产生小规模的流行［7］。MP所致上呼吸道和下呼吸道感染与年龄有关系，3岁以下幼儿以上呼吸道感染为多，5～20岁年龄组人群以支气管炎和肺炎为主要表现，成人则以肺炎多见［8］。本研究结果显示小鼠经MP接种后，于第3天即出现明显的炎性反应，7 d后炎症明显，14 d后炎症逐渐减轻并于30 d时基本消退，提示小鼠经MP接种后出现以炎性反应为特征的病变，其结果与文献报道［2］基本一致。目前研究显示MP的发病与免疫机制密切相关，多种细胞因子在其发病过程中起重要作用［9］。随着对该病研究逐步深入，LT及其受体家族在气道炎症和免疫反应中的作用越来越得到重视。

图4 CysLTs-R蛋白表达分析Fig.4 Expression analysis of CysLTs-R protein in each group

LT是花生四烯酸经5-脂氧合酶途径合成的一类炎性介质，发挥生理作用是通过特定的受体，即白三烯受体而产生的，而哮喘的白三烯介导途径主要是通过CysLTs受体产生的［10］。CysLTs在体内含量虽微，但是却有很高的生理活性，并且是某些变态反应、炎症以及循环、呼吸系统等疾病中的重要的化学介质，其中LTC4、LTD4、LTE4都是很重要的炎性介质和强气道、血管收缩剂，白三烯对支气管的收缩作用是组胺的1 000～10 000倍［11］。

MP感染刺激多种细胞和细胞组分（肥大细胞、上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞）释放了一系列细胞因子和黏附分子浸润气道，引起气道持续性炎症和气道的重建。一些研究认为，MP感染致敏和激发的BALB/c小鼠可以使其气管支气管黏膜下层出现胶原蛋白沉积而导致气道重塑，从而引发更为严重的气道反应性增加和哮喘症状［12］。亦有实验报道MP感染患儿血清白三烯、尿白三烯水平明显高于正常对照组［13］。本实验深入研究了MP感染的BALB/c小鼠不同时间点BALF中CysLTs和肺组织CysLTs-R在气管和肺组织的表达情况。ELISA检测结果表明，与正常组比较，MP组BALF中CysLTs含量明显增高（P＜0.05），于感染后7 d和14 d达到高峰，而后呈下降趋势；免疫组化结果显示，在MP感染后，CysLTs-R蛋白在气管上皮细胞表面的表达增强；Western blot结果显示不同感染组中CysLTs-R蛋白的表达量均高于正常对照组。由此可见，MP感染小鼠后CysLTs-R在肺组织中的表达呈先升高后降低的波动过程。

综上所述，MP感染BALB/c小鼠后，体内CysLTs含量呈现先升高后降低的趋势，且CysLTs含量最低时也显著高于正常对照组；同时，在各级支气管上皮细胞表达的CysLTs-R蛋白也呈现相似的先升高后降低的波动过程。说明体内CysLTs含量与MP的感染具有相关性，这一结论为进一步研究MP的感染机制奠定了良好的基础。

［1］Okelo SO，Butz AM，Sharma R，et al.Interventions to modify health care provider adherence to asthma guidelines：a systematic review［J］.Pediatrics，2013，132（3）：517-534.

［2］Kim MH，Kang SY，Lee WI，et al.Comparison of two enzyme immunoassays for detecting mycoplasma pneumonia［J］.Lab Med，2012，43（4）：74-77.

［3］Jensen ME，Gibson PG，Collins CE，et al.Airway and systemic inflammation in obese children with asthma［J］.Eur Respir J，2013，42（4）：1012-1019.

［4］Pemira SM，Tolan RW.Mycoplasma pneumoniae infection presenting as bullous papular purpuric gloves and socks syndrome：novel association and review of the literature［J］.Clin Pediatr（Phila），2011，50（12）：1140-1143.

［5］Arkilo D，Pierce B，Ritter F，et al.Diverse seizure presentation of acute mycoplasma pneumoniae encephalitis resolving with immunotherapy［J］.J Child Neurol，2013，10（5）：1177-1180.

［6］Back M.Functional characteristics of cysteinyl-leukotriene receptor subtypes［J］.Life Sciences，2002，71（6）：611-622.

［7］张晗，尚云晓.支原体感染与支气管哮喘［J］.国外医学：儿科学分册，2003，30（5）：236-239.

［8］Cho KJ，Seo JM，Shin Y，et al.Blockade of airway inflammation and hyperresponsiveness by inhibition of BLT2，a low-affinity leukotriene B4 receptor［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2010，42（3）：294-303.

［9］Pierse N，Arnold R，Keall M，et al.Modelling the effects of low indoor temperatures on the lung function of children with asthma［J］. J Epidemiol Community Health，2013，67（11）：918-925.

［10］Seo KY，Won DI，Cho MH，et al.Flow cytometric measurement of cold agglutinins for diagnosing mycoplasma pneumoniae pneumonia［J］.Lab Med，2012，43（12）：68-73.

［11］Blasi F，Johnston SL.The role of antibiotics in asthma［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，29（5）：485-493.

［12］王莉，蔡栩栩，张晗，等.维生素D受体及cathelin相关抗菌肽在肺炎支原体感染小鼠肺组织中的动态表达及作用［J］.中国医科大学学报，2013，42（10）：885-890

［13］Andrews KL，Jones SC，Mullan J，et al.Stigma：still an important issue for adults with asthma［J］.J Asthma Allergy Ed，2013，4（11）：165-171.

［14］Garcia G，Taillé C，Laveneziana P，et al.Anti-interleukin-5 therapy in severe asthma［J］.Eur Respir Rev，2013，22（5）：251-257.

（编辑武玉欣）

Influence ofMycoplasma Pneumonia Infection on the Expression ofLeukotriene and Its Receptor in BALB/c Mice

JIAOXu-yong1，ZHANGHan1，SHANGYun-xiao1，HE Meng-bo2，WANGLi1，WANG Gui-zhen2
（1.Department of Paediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Microbiology and Parasitology，Basic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110005，China）

ObjectiveTo investigate the expression of leukotriene and its receptor in BALB/c mice infected by mycoplasma pneumonia.MethodsA total of 100 BALB/c mice were randomly divided into mycoplasma pneumoniae（MP）infection group（MP group）and PBS control group（N group）（n=50）.Five mice were sacrificed from each group afterthe vaccination 3 d，7 d，14 d，21 d and 30 d，respectively，and lung tissue wascollected for harvest of alveolar perfusate（BALF）.CysLTs content was determined using ELISA kit；the rest of the lung tissue was fixed in formalin for sections，HE staining wasperformed forthe observation ofhistologicalchanges；CysLTs-Rexpression wasdetected by both immunohistochemicalassay and western blotanalysis.ResultsAs shown in histopathologicalobservation results，interstitialinflammatory changes occurred 3 d after MP infection，significantly increased on day 7，then gradually decreased after day 14，and was basically subsided on day 30；ELISA test results show that compared with normal group，MP CysLTs in BALF were significantly increased（P＜0.05），which peaked at day 7 and day 14 and then declined；immunohistochemistry analysis showed that CysLTs-R protein expression on the cell surface was enhanced in tracheal epithelial after MP infection；Western blotanalysis showed lung tissue CysLTs-Rprotein expression levels higherafterinfection atalltested time points than the Ngroup.Conclu⁃sionMPinfection can significantly increase the CysLTsand CysLTs-R expression in normalBALB/c mice.

mycoplasma pneumoniae；cysteinyl leukotriene；cysteinyl leukotriene receptor；BALB/c mouse

R725.6

A

0258-4646（2014）03-0226-05

辽宁省自然科学基金（2013021020）

焦旭勇（1986-），男，硕士研究生.

尚云晓，E-mail：shangyunx@sina.com

2013-11-04

网络出版时间：