水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用

周恒伟，邹丹，白大峰，金戈，唐迪莹，张祖源，王蒙，李欣欣，张怡光

（1.沈阳市苏家屯区中心医院门诊药房，沈阳110101；2.沈阳医学院基础医学院药理学教研室，沈阳110034）

水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用

周恒伟1，邹丹2，白大峰1，金戈2，唐迪莹2，张祖源2，王蒙2，李欣欣2，张怡光2

（1.沈阳市苏家屯区中心医院门诊药房，沈阳110101；2.沈阳医学院基础医学院药理学教研室，沈阳110034）

目的探讨水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠学习记忆障碍的改善作用。方法健康费城癌症研究所（ICR）小鼠（60只）随机均分为4组：假手术组、模型组、多奈哌齐组、水飞蓟宾低剂量（100 mg·kg-1·d-1）组和水飞蓟宾高剂量（200 mg·kg-1·d-1）组。连续给药8 d，行为学评价学习记忆的改善作用。结果与模型组比较，水飞蓟宾高剂量组自发反应交替率，1 h、24 h优先指数显著升高（P＜0.01）。ELISA检测结果显示：与模型组比较，水飞蓟宾高剂量组IL-6表达显著降低，水飞蓟宾高剂量组IL-4表达显著减少（P＜0.01）。结论水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠学习记忆障碍有明显的改善作用。其机制可能通过降低脑组织中的炎症相关因子水平有关。

水飞蓟宾；学习记忆障碍；炎性因子

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，主要表现为记忆力减退、严重认知功能障碍和人格异常［1］。此病起病隐匿，病程进行缓慢，是老年痴呆中最常见的一种类型。AD患者脑内的主要病理改变包括细胞外以β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积为中心形成的老年斑（senile plaques，SP）、过度磷酸化tau蛋白造成的细胞内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）、选择性神经元丢失及神经营养不良、突触丢失等。此外，AD的产生和发展还与炎性反应、线粒体结构功能异常等密切相关［2］。研究报道，水飞蓟宾能够对抗Aβ引起的短期空间记忆、长期识别记忆以及关联记忆的损伤，但是并不影响小鼠的运动能力、探索行为和痛阈。此外，水飞蓟宾显著抑制Aβ诱导的海马区丙二醛（malondialdehyde，MDA）的产生，同时升高谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平［3］。为了进一步探索水飞蓟宾在AD治疗中的作用，本研究探讨水飞蓟宾对Aβ1-42致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠侧脑室注射凝聚态Aβ1-42致痴呆模型的制作：清洁级健康费城癌症研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠60只，雄性，体质量24～30 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供。小鼠水合氯醛麻醉后，微量进样器侧脑室一次性注入4 μL凝聚态Aβ1-42（含Aβ1-42 410 pmol）。留针2 min，假手术组小鼠侧脑室给予等体积生理盐水。Aβ1-42预处理：无菌生理盐水溶解后，37℃120 h使其成凝聚态。

1.1.2 实验动物分组及给药：造模后实验动物随机分为假手术组、模型组、多奈哌齐组、水飞蓟宾低剂量组和水飞蓟宾高剂量组。实验小鼠适应性喂养3 d后给药。假手术组及模型组按体质量给予生理盐水，多奈哌齐组给予多奈哌齐（1.3 mg·kg-1·d-1），水飞蓟宾组给予不同剂量水飞蓟宾（低剂量为100 mg·kg-1·d-1；高剂量为200 mg·kg-1·d-1）；恒温恒湿环境下饲养［（24±1）℃，（40±4）%］，12 h循环灯光（08：00-20：00），自由摄食及饮水。给药期间每天称重，观察动物状态并记录。连续给药8 d后进行相关实验。

1.1.3 药品、试剂及仪器

水飞蓟宾（河南协力药业公司，批号：20130804）、A β 1-42（Sigama公司，批号：1001602474）、小鼠白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）ELISA试剂盒（货号：MU30384，上海邦亦生物公司）、小鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（货号：MU30044，上海邦亦生物公司）。酶标定量测试仪（奥地利特TECAN公司）、-80℃低温冰箱（中科美菱）；J2-SH低温超速离心机（美国BECKMAN公司）；机械匀浆机（上海净信科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Y迷宫：实验装置由3个成120°夹角的等长木制支臂组成，即迷宫的A、B、C 3臂。每臂长40 cm，高12 cm，上宽10 cm，下宽4 cm。实验时将小鼠放入3个臂交接处，让其自由出入3个臂，记录4 min内每只小鼠进入3个臂的顺序及总次数，以连续进入3个不同的臂为1次正确交替反应，记录正确交替反应次数。用自发交替反应率反映空间工作记忆能力。自发反应交替率（%）=正确进臂次数/（进臂总次数-2）×100［4］。

1.2.2 小鼠新物体辨别：本实验分为适应环境阶段和测试阶段。适应环境阶段：每只小鼠放入测试箱自由探索10 min，连续2 d。测试阶段，同样小鼠适应环境3 min，然后将小鼠取出。将2个完全相同的测试物体（A1、A2）置于测试箱距箱壁8 cm处呈直线排开。每组小鼠面向盒壁放入盒中，记录4 min内探索两物体的时间（tA1、tA2）。1 h后，将其中原来测试物体物体中1个换成1个新物体（B），将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间（tA1、tB）。24 h后，将物体B换成1个新物体（C），将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间（tA1、tC）。优先指数计算公式：Preferential inde（x1 h/24 h）=tB（/tA1+tB）［4］。

1.2.3 酶联免疫法测定海马组织IL-6、IL-4含量：各组小鼠于给药后第8天处死，皮层海马组织样本放于-80°C冰箱备用。每只鼠取10 mg海马组织加入140 μL PBS溶液中，超声匀浆后3 000g离心14 min后，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书操作，每孔加样品40 μL，经37℃温育30 min，洗涤4次，37℃避光显色14 min，终止反应后440 nm波长依序测量各孔的吸光度（optical density，OD）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 自发交替反应实验结果

实验结果表明：假手术组、模型组、多奈哌齐组、水飞蓟宾低剂量组和水飞蓟宾高剂量组小鼠进入Y迷宫3个臂的总次数分别为23.818±3.646、26.012±6.884、24.364±7.684、22.182±4.240、24.444± 7.034，组间未见统计学差异（P＞0.04）。提示水飞蓟宾未对小鼠自发活动产生明显影响。与假手术组比较，模型组小鼠Y迷宫自发交替反应率显著下降（P＜0.001）；与模型组比较，水飞蓟宾剂量依赖性增加小鼠Y迷宫自发交替反应率（P＜0.01）。见表1。

2.2 新物体辨别实验结果

结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠1 h及24 h测试阶段的优先指数和辨别系数显著降低（P＜0.001）。与模型组比较，水飞蓟宾剂量依赖性升高模型鼠1 h及24 h测试阶段的优先指数（P＜0.01），见表2、3。

2.3 各组小鼠海马组织IL-4、IL-6含量结果

表1 水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42各组小鼠自发交替反应率及进臂总次数影响（%）Tab.1 Effects of silibinin on the impairment of spontaneous alteration behavior induced by ICV Aβ1-42 in the Y-maze test（%）

表2 水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠新物体辨别1 h及24 h优先指数的影响（%）Tab.2 Effects of silibinin on preferential index for new object of 1 h and 24 h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

表3 水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠新物体辨别1h及24 h辨别系数的影响（%）Tab.3 Effects of silibinin on discrimination index for new object of 1h and 24h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠抗炎因子IL-4显著降低而促炎性因子IL-6升高（P＜0.01），与模型相比较，水飞蓟宾显著增加抗炎因子IL-4表达（P＜0.04），降低IL-6表达（P＜0.01）。见表4。

3 讨论

神经病理学研究揭示了炎症与AD密切相关。AD患者尸检显示，脑组织内促炎性因子增加，尤其是在斑块附近增加的更加明显［6］。IL-6是一种多向性的细胞因子，与其水溶性受体或膜受体结合后形成有活性的IL-6受体复合物，介导免疫应答和炎性反应，调节中枢神经系统细胞生长和分化。自1991年Bauer等［7］在AD患者脑中发现IL-6以来，已经有大量的研究结果表明，IL-6在AD的发生发展中发挥重要作用。IL-4是抗炎性细胞因子，诱导成熟T2型辅助细胞（Th2细胞）、肥大细胞或嗜碱性粒细胞，能够趋化Th2应答之一；介导肥大细胞的募集和活化，刺激IgE抗体产生［8］。研究表明IL-4参与AD的发病机制［9］。AD患者基底核及外周单核细胞的IL-4较正常对照组均减少［10］。流行病学及临床观察发现抗炎药物可延迟AD发病，减缓AD进程并改善AD的认知障碍。因此抗炎机制成为防治AD的一个新的研究方向。

表4 水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠海马IL-4，IL-6影响Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

表4 水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42小鼠海马IL-4，IL-6影响Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

1）P＜0.01 compared with sham group；2）P＜0.04；3）P＜0.01 compared with model group.

水飞蓟宾为黄酮类化合物，文献报道具有抗氧化、抗炎及神经保护作用［11］。本次实验我们考察水飞蓟宾是否可以通过减少炎性因子表达而产生改善学习障碍的作用，行为学Y迷宫检测得出水飞蓟宾对侧脑室注射Aβ1-42模型鼠空间记忆的改善作用；新物体辨别实验主要考察药物对侧脑室注射Aβ 1-42模型鼠视觉辨别能力的改善作用，结果显示水飞蓟宾高剂量组对AD模型小鼠学习记忆障碍改善作用显著。与文献报道的研究结果一致［3］。实验中，我们对小鼠侧脑室注射Aβ后8 d海马内促炎性因子IL-6含量及抗炎性因子IL-4含量进行了测定。结果表明水飞蓟宾在改善模型小鼠学习记忆障碍的同时，可剂量依赖性地抑制痴呆小鼠海马IL-6表达的增加及IL-4表达的减少。提示水飞蓟宾改善认知及记忆障碍作用与中枢抗炎作用相关。前期的研究结果显示水飞蓟的抗氧化作用明显，能够改善药源性肾损伤［12］，是否可以通过抗氧化作用和神经保护作用改善学习记忆障碍还有待进一步探讨。

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（编辑 武玉欣）

Silibinin ImprovementofLearning and Memory Disordersin a Dementia Mouse ModelInduced by Intracerebroventricular Injection ofAβ1-42

ZHOU Heng-wei1，ZOU Dan2，BAI Da-feng1，JIN Ge2，TANG Di-ying2，ZHANG Zhu-yuan2，WANG Meng2，LI Xin-xin2，ZHANGYi-guang2
（1.Bureau of Outpatient Medicine，Sujiatun District Central Hospital，Shenyang 110101，China；2.Deparment of Pharmacology，School of Basic Medicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo observe the effectsofsilibinin on the improvementoflearning and memory impairmentin a mouse modelinjected with Aβ 1-42.MethodsA total of 60 healthy ICR mice were randomly divided into sham group，model group，the donepezil group，silibinin low-dose group，silibinin high-dose group.After8 days administration，behavioraltests were performed to evaluate the learning and memory improvement.Re⁃sultsCompared with the modelgroup，spontaneous alternation behavior，1 hourand 24 hourpreferentialindex silibinin high dose group were significantly improved in silibinin high-dose group.ELISA testshowed that：compared with the modelgroup，silibinin treatmentsignificantly reduced IL-6 and IL-4 expression（P＜0.01）.ConclusionSilibinin significantly improved learning and memory disorders in the mouse dementia model induced by intracerebroventricularinjection ofAβ1-42.The reduction ofinflammation factorlevels in the brain tissue could be one ofthe mechanisms.

silibinin；learning and memory impairment；inflammatory cytokines

R964

A

0248-4646（2014）04-0341-03

沈阳市科学技术计划（F13-220-9-27）；辽宁省教育厅高校科研计划（L2010447）

周恒伟（1976-），男，主管药师，本科.

金戈，E-mail：jinge1026@163.com

2014-02-19

网络出版时间：